用分子生物学技术对草菇进行菌株鉴别

利用ＡＰ－ＰＣＲ和ＲＡＰＤ技术对三个草菇菌株进行鉴别,其结果与用草菇菌株Ｖ３４基因文库中的中等重复序列为探针进行限制性内切酶长度多态性分析（ＲＦＬＰ）,及对编码核糖体５．８ＳｒＲＮＡ的ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）进行ＰＣＲ扩增后的产物进行限制性内切酶长主多态性分析（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）的结果相一致。这一结果显示出用这四种方法对草菇菌株进行鉴别具有相似的效果。同时用这四种方法构建的分子生物学标记显示出这三个菌株     

球形幽门螺杆菌分子生物学研究

为研究幽门螺杆菌（ＨＰ）球形变异本质,作者通过延期培养和采用亚抑菌浓度抗生素,使３株ＨＰ发生球形变异,对弯曲形和球形ＨＰ作了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及４个毒力基因片段ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱显示球形ＨＰ分子量在７４×１０４以上的蛋白含量减少,免疫印迹显示球形ＨＰ１２５×１０４蛋白条带反应减弱,而抗生素诱变的球形ＨＰ分子量为１１×１０４和６３×１０４的蛋白条带反应增强。ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结果表明球形ＨＰ的ｈｐａＡ,ＶａｃＡ,ＣａｇＡ和ＵｒｅＡ４个毒力基因片段未发生缺失,但在ｈｐａＡ或ＶａｃＡ基因中存在点突变     

肾综合征出血热病毒基因检测及分型的研究

根据流行于我国的两型ＨＦＲＳＶ代表株汉滩型７６１１８株及汉城型Ｒ２２株Ｍ节段的核酸序列,设计两型共同引物,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法,检测３９株从不同地区、不同宿主分离的ＨＦＲＳＶ感染鼠脑及细胞培养物;同时还建立了捕捉ＥＬＩＳＡ法（ｃＥＬＩＳＡ）,检测了３９株中的３６株,每份样本设复孔,以Ｐ／Ｎ≥２．１０且Ｐ－Ｎ≥０．１０者判为阳性。ＲＴＰＣＲ及ｃＥＬＩＳＡ两法的检出率分别为９７．６％与８２．４％,二者符合率８４．６％。此外,对ＲＴＰＣＲ产物进行酶切分型,３８份扩增产物中的１５份可被ＡｌｕＩ切开。根据所获酶切图谱的差异,可分为汉滩型及汉城型两型,显示了酶切分型的潜在价值     

人神经生长因子低亲和力受体（p~（75）NGFR）cDNA的克隆及其在神经细胞中表达活性的初步研究

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胎儿基底前脑中提取总ＲＮＡ,用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人神经生长因子低亲和力受体ｐ~（７５）ＮＧＦＲ基因ｃＤＮＡ,在限制性内切酶ＳｍａⅠ存在下的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＵＣ１２的ＳｍａⅠ位或,经限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＰｓｔⅠ酶切鉴定是否插入以及ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定方向。将重组质粒中的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ再次亚克隆至ｐＵＣ１２载体中后,以其双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测出其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ除两个碱基突变外,其余与文献完全一致。完整的ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的ｃＤＮＡ分两步克隆到逆转录病毒表达载体ｐＸＴ－１,经ＰＡ３１７包装细胞株体外包装后、收集病毒上清转染条件不死性大鼠小脑神经细胞系Ｒ２．初步结果表明转染了ｐ~（７５）ＮＧＦＲ的Ｒ２细胞株去除ＮＧＦ培养时出现程序化死亡的典型特征梯型ＤＮＡ带。     

鸡减蛋综合征病毒（EDSV—76）基因组E1区结构特点分析

ＥＤＳＶ－７６病毒中国株ＡＡ－２经常规方法提取其病毒ＤＮＡ后,建立了限制性内切酶ＰｓｔＩ水解片段的全基因文库。对其中ＰｓｔＩ－Ｇ片段和ＰｓｔＩ－Ａ片段的正反链进行序列测定,获得ＥＤＳＶ Ｅ１区（０－８．８ｍ．ｕ）的核苷酸序列。经分析,ＥＤＳＶ Ｅ１区具有与其他腺病毒Ｅ１区类似的结构。以大于６０个氨基酸残基为标准,ＥＤＳＶ Ｅ１区共有７个开放读码框架（ＯＲＦ）,其中Ｒ１、Ｒ２、ＥｌｂｓＴ和Ｅ１ｂ１Ｔ     

苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因在小麦基因组中的甲基化修饰

通过花粉管通道法将苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒蛋白基因（Ｂｔ．ｔｏｘｉｎｇｅｎｅ）转进了小麦品种京花５号与８６Ａｌ。利用点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ等技术鉴定了转化植株的当代和子代,证实了Ｂｔｔｏｘｉｎｇｅｎｅ的导入与对小麦染色体的整合。利用对腺嘌呤（Ａ）与胞嘧啶（Ｃ）甲基化敏感与否的限制性内切酶组（ｍｅｄｈｙｌａｔｉｏｎ－（ｕｎ）ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｇｒｏｕｐ,ＭＲＥＧ）酶切和ＲＣＲ扩增（ＭＲＥＧ－ＰＣＲ）,对转化子代中的Ｂｔ基因片段甲基化形式进行了研究。结果表明,整合在小麦基因组中的Ｂｔ基因的Ａ和Ｃ的甲基化形式发生了变化     

应用逆转录聚合酶链反应法扩增类胰岛素生长因子Ⅱ基因

利用酸性异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法从人胚胎组织中提取总ＲＮＡ,经Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离纯化出ｍＲＮＡ。用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ的ｃＤＮＡ片段,在限制性内切酶ＳｍａＩ存在的连接体系中,将扩增出的ｃＤＮＡ片段克隆进ＰＵＣ１２的ＳｍａＩ位点处。经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ,ＳａｌＩ,Ｅｃｏ４７Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链ＤＮＡ为模板,用末端终止法测     

应用聚合酶链反应对我国不同来源肾综合征出血热病霉的型别分析

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）,对分离自不同地区、不同宿主来源的２６株肾综合征出血热病毒进行了分型,其中包括４个型别的国际标准株,用异硫氰酸胍－酚－氯仿方法从感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞中提取总ＲＮＡ,设计了５对寡核苷酸引物,一对为汉坦病毒特异性引物;４对为不同型特异性引物。ＰＣＲ分型表明,２６株中除１株Ｒｒ可同时被汉坦（ＨＹＮ）和Ｓｅｏｕｌ（ＳＥＯ）两型特异性引物扩增外,其余２５株分别只被４个型别引物中的一个所扩增,依次为ＨＴＮ１６株,ＳＥＯ７株,Ｐｕｕｍａｌａ（ＰＵＵ）１株,ＰｒｏｓｐｅｃｔＨｉｌｌ（ＰＨ）１株。ＰＣＲ分型的结果与空斑减少中和试验完全一致,表明ＰＣＲ可以对肾综合征出血热病毒准成分型。应用限制性内切酶分析了扩增产物,结果与理论基本一致,证实了扩增产物的特异性。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．     

节丛孢属rDNA ITS区RFLPs分析

利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法对捕食线虫真菌节丛孢属进行了系统发育研究。以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物对该属１０种１２个菌株的核糖体ＤＮＡ转录间区（ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增,４种内切酶（ＡｌｕⅠ、ＨａｅⅢ、ＨｐａⅡ、ＴａｑⅠ）酶切。结果表明该属的ＩＴＳ区长度没有明显差异,其长度范围在６５８－７０５之间,酶切图谱能体现不同种间的多态性,根据４种内切酶酶切结果,利用ＵＰＧＭＡ法构建的节丛孢属分子系统树,基于体现     

常用实验用近交系小鼠粒体ＤＮＡ遗传变异的分析

应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术,研究了分析了国内常用的实验用近交系小鼠线粒体ＤＮＡ（mtＤＮＡ）的品种间遗传变异。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析发现,小鼠mtＤＮＡ的Ｄ－loop、tRNA^Met Glu Ile及ＮＤ３基因核酸序列,在４６个限制性内切酶酶切位点上均无差异;用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析方法对这些小鼠mtＤＮＡ的高变异区Ｄ－Loop的５′及3′端作进一步分析,亦未发现品种间遗传变异。结合mtＤＮＡ具有的母系遗传方式的特点,这一结果提示：常用的实验用近交系小鼠形成中可能只有１种雌性血统起了作用。     

PCR-SSP技术对广东汉族人HLA-DR基因分型

探索具有高分辨率、高特异性和简捷快速的方法对ＨＬＡ－ＤＲ基因分型,为临床器官移植配型和疾病相关性分析提供实用的方法和基础资料．利用ＤＲ１～ＤＲｗ１８序列特异性的１９组引物及１对内参照引物进行ＰＣＲ扩增即ＰＣＲ－ＳＳＰ对ＨＬＡ－ＤＲ进行基因分型,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,在紫外光下观察分型结果．每个被检个体的ＤＲ型别可由特异引物扩增出现的电泳谱带直接判断．双盲检测２２例的结果１００％正确．在１０２例中国广东地区汉族人中,ＤＲ９和ＤＲ２的基因频率最高,分别为０．２２０５和０．１９１２,ＤＲ１０为最低（０．００９８）．与用ＰＣＲ－ＳＳＯ方法分型获得的结果比较,基因型别分布基本一致,但一些等位基因的频率有差异,表明ＨＬＡ－ＤＲ基因频率的分布在不同地区、不同种族的人群间存在着差异．ＰＣＲ－ＳＳＰ法分辨率和特异性虽不及ＰＣＲ－ＳＳＯ法但比血清学方法精细,分型的全过程只需２～４ｈ能满足临床器官移植配型的要求．基因频率调查结果为器官移植配型和疾病相关性分析提供了基础资料．     

汉坦病毒的分子生物学分型

汉坦病毒的分型是近年来的一个研究热点,本文就汉坦病毒分型研究中的分子生物学方法进行了综述,包括逆转录－多聚酶链反应结合限制性核酸内切酶图谱分析,分型ＰＣＲ以及系统进化分析等。     

r－干扰素对喉癌细胞系HEP－2HLA－DR抗原和增殖细胞核抗原表达的影响

本实验用人重组ｒ－干扰素（ｒｈｕ－ＩＦＮ）作用ＨＥＰ－２细胞后ＨＬＡ－ＤＲ抗原和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达的检测来探讨ｒ－干扰素对ＨＥＰ－２细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原表达诱导作用及体外抗增殖活性。用单克隆抗体ＣＲ３／４３（抗ＨＬＡ－ＤＲ）和Ｋｉ－６７（抗ＰＣＮＡ）。以链霉素一生物素技术（ＬＳＡＢ）检测ＨＥＰ－２细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原和ＰＣＮＡ表达,结果显示：ｒ－ＩＥＮ诱导ＨＬＡ－ＤＲ抗原和抑制ＰＣＮＡ表达其强弱与ｒ－ＩＦＮ剂量有关。资料提示：ｒ－ＩＦＮ不仅对ＨＥＰ－２细胞有细胞毒作用,同时能调节其细胞膜特性,因而在喉癌的治疗中是有效的。     

幽门螺杆菌的分子指纹法研究进展

分子指纹法包括：细菌全细胞蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱分析法,染色体ＤＮＡ限制酶酶切图谱分析法,ｒＲＮＡ基因限制酶酶切图谱分析法。分子指纹法能敏感表达幽门螺杆菌（ＨＰ）基因变异,从菌株水平准确鉴定ＨＰ,并应用于ＨＰ感染复发,耐药性,致病机理和分子流行病学等重要问题的研究中。     

采用PCR-RFLP和RAPD对球壳孢目真菌系统学的研究

对球壳孢目真菌首次采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ进行了系统发育研究。以ＩＴＳ１和ＩＴＳ４为引物对４属１２种２４个菌株的核糖体ＤＮＡ转录间区（ＩＴＳ）进行了ＰＣＲ扩增,４种内切酶（ＡｌｕＩ,Ｈｈａ,ＭｓｐＩ,ＴａｑＩ）酶切,结果表明：主要属的ＩＴＳ区长度不同,同属不同种相同。Ｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍ,Ｐｈｙｌｏｓｔｉｃｔａ,Ａｓｃｏｃｈｙｔａ,ＳｅｐｔｏｒｉａＩＴＳ区长度分别为６３０,５６０,５５０,５４０ｂｐ;酶切图谱属间差别明显,属内种间基本一致,暗示传统的分种可能过细,某些种的成立还有商榷的余地,ＰＣＲ－ＲＦＬＰ对确定疑难种属的地位有重要的意义。３属８种１６个菌株的ＲＡＰＤ结果表明,种内图谱相同或图谱类型相同,而种间明显不同,揭示出过去所划分的种的确存在本质的差别,但是否达到种级的差别还有待于进一步研究     

用RFLP和PCR—RFLP技术研究东北虎和华南虎线粒体DNA多态性

采用ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ和ＰＣＲＲＦＬＰ技术研究了东北虎和华南虎的ｍｔＤＮＡ的多态性。在ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ研究中,分离纯化了东北虎和华南虎肝、肾和心脏组织的ｍｔＤＮＡ,用２０种识别６碱基对的限制性内切酶消化,结果只有１种限制性内切酶（ＸｂａⅠ）检测到多态性片段,其余１９种限制性内切酶消化产生的限制性格局在东北虎和华南虎完全一致。在ＰＣＲＲＦＬＰ研究中,用ＰＣＲ技术分别扩增了东北虎和华南虎ｍｔＤＮＡ的控制区（ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ）,用８种识别４碱基对的限制性内切酶分别对扩增产物进行消化,结果只有１种限制性内切酶（ＲｓａⅠ）检测到多态性片段。ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰ的结果均提示东北虎和华南虎之间的遗传距离极小。这可能与下列因素有关：两者分布区间无天然隔离屏障;具有强扩散能力;近几百年才被相互隔离。     

RT—nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿（ＡＧＰＣ）一步法提取病毒ＲＮＡ,并依据肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物,建立了逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测ＨＦＲＳＶＲＮＡ方法,应用此法对ＨＦＲＳＶ感染的ＶｅｒｏＥ６细胞培养液及ＨＦＲＳ患者血清中的病毒ＲＮＡ进行检测。结果显示,感染细胞培养液及３５例ＨＦＲＳ患者血清均为阳性,正常的ＶｅｒｏＥ６     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣ ＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＧＤＦ）、ＰＧＤＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或     

幽门螺杆菌的RFLP分型的研究

建立敏感度高、重复性好的基因分型方法,对探讨幽门螺杆菌（ＨＰ）感染的传染源、传播途径及复发原因具有重要意义。本文综合介绍了ＨＰ的限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分型方法的类型、原理、优缺点及取得的主要进展。研究表明,ＨＰ感染的复发主要是由于同一菌株的复发,而不是新菌株的重新感染。