PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

杉木解酚菌的研究

从杉木林土壤中筛选到5株高效解酚菌(F₂、F₃、F₄、F₇、F₁₅),结果表明,F₄、Fd,F₂、F₁₅5d能将600rng·L^-1的阿魏酸降解完,F₇的降解率为91.3%;F₄、F₃、F₂、F₇d,F₁₅、4d能将600mg·L^-1的对羟基苯甲酸完全降解;5株解酚菌对邻香草醛的降解能力较弱,除F₂5d能将300mg·L^-1的邻香草醛完全降解外,其余4株5d的降解率为83%～96%.同时发现,F₄能抑制杉苗生长,而其余4株则能在不同条件下促进杉苗生长,将5种菌按等比例混合使用,在土壤添加酚酸的情况下,仍能促进菌根苗Z和非菌根苗生长,杉木苗干重增长率为8.9%～168%.     

草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F1倍性分析和性腺发育特点

为探讨草鱼(Ctenopharyngodon idella♀)×赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus♂)杂交F₁的倍性和生育性能, 对杂交F₁的染色体核型和红细胞核DNA含量进行分析和测定, 并运用组织学方法对繁殖期和非繁殖期共124尾杂交F₁的性腺发育特点进行研究。结果显示: (1)杂交F₁染色体2n=48, 核型公式2n=26 m+20 sm+2 st, NF=94, 未发现端部着丝点染色体、随体和次缢痕等结构; (2)杂交F₁相对DNA含量为对照组鸡血的1.29倍, 其绝对DNA含量为(3.21±0.61) pg/N, DNA指数为0.92; (3)经解剖观察和切片鉴定, 杂交F₁卵细胞分为两种类型: 一类卵细胞第Ⅰ—Ⅴ时相均发育正常, 可完成排卵并产生后代, 为正常发育型; 另一类卵细胞发育到第Ⅴ时相后, 卵黄颗粒减少, 油滴增加, 呈无卵黄空洞状, 为异常发育型。杂交F₁精巢包括初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞, 无成熟精子; 部分精小囊内精细胞量极少, 多为结缔组织或脂肪组织; 生产实践中暂未发现可以排精的杂交F₁个体。研究表明, 草鱼与赤眼鳟杂交获得的杂交F₁为二倍体, 部分雌性可育, 雄性可能为败育群体。     

猪脾转移因子对La Sota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫增强作用

【目的】本文旨在研究猪脾转移因子（TF）对新城疫（ND）病毒弱毒疫苗La Sota株的免疫增强作用及机理,为兽医临床防控提供理论依据。【方法】以4种不同剂量La Sota疫苗株分别单独、与TF联合免疫SPF鸡,14 d后以ND病毒（NDV）参考强毒F₄₈E₉株(10^4.7 ELD₅₀)进行攻毒,采用蛋白质芯片技术测定鸡外周血IL-6、IL-10、IL-16和IL-21浓度,并以血凝抑制（HI）试验和荧光定量RT-PCR方法分别检测鸡ND HI抗体效价和F₄₈E₉株的病毒血症水平。【结果】攻毒保护试验表明,单独免疫10^5.17、10^4.17、10^3.17和10^2.17 EID₅₀剂量时疫苗攻毒保护率分别为100%、55%、0%和0%,半数保护量(PD₅₀)为12 023 EID₅₀;对应剂量联合免疫时疫苗攻...     

草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1及其亲本CAST基因cDNA全长克隆与结构差异

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)在肌肉生长和肉质特征形成中发挥重要作用。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus) (♀)×赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus) (♂)正交F₁的肉质相关分子基础, 通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends) 技术分别克隆了草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F₁及其亲本的CAST基因cDNA全长, 并利用生物信息学方法分析比较了三种鱼的CAST结构差异。结果表明: 草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F₁的CAST基因cDNA全长分别为3036、3165和3086 bp, 编码901、893和904个氨基酸; 预测蛋白质分子量分别为93.72、92.77和94.02 kD; 推测的理论等电点分别为5.92、6.01和6.02。草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F₁ CAST与草鱼(♀)和赤眼鳟(♂)核苷酸序列相似性分别为94.52%和90%。三种CAST蛋白均包括4个含有典型七肽的钙蛋白酶抑制结构域。草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F₁ CAST氨基酸残基中分别存在73、82和75个潜在的磷酸化修饰位点。蛋白三级结构分析显示草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F₁ CAST中分别含有24、12和20个β-折叠, 且均呈链状结构。综合可知, F₁ CAST在序列相似度、磷酸化位点数、蛋白质结构及进化地位与草鱼(♀)均更接近。该研究结果为阐明草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)正交F₁肉质形成机理提供了分子基础。     

银染色方法及其在细胞遗传学中的应用

硝酸银染色在细胞化学中的应用已有很久的历史,但用以研究染色体却是近几年的事。Goodpasture等应用称为Ag-AS的银染色技术,使9种哺乳动物的核仁组织者(NOR)特异性染为黑色。这种银染色阳性的NOR称为     

贝氏小奥林螨连续饲养的草栖钝绥螨生命表参数和捕食能力

【目的】替代食物是饲养扩繁生物防治剂的重要组成部分,但连续单一食物可能会对天敌的存活、繁殖和捕食能力产生影响。本研究旨在明确以贝氏小奥林螨Oulenziella bakeri饲养的草栖钝绥螨Amblyseius herbicolus生长发育状况、繁殖和捕食能力。【方法】利用年龄-龄期两性生命表和捕食功能反应分别测定以贝氏小奥林螨为替代猎物的F₂, F₄和F₆代草栖钝绥螨生命表参数和对二斑叶螨Tetranychus urticae的捕食能力。【结果】在F₂, F₄和F₆代,草栖钝绥螨幼螨期随着饲养代数的增加逐渐延长,而雌成螨和雄成螨的寿命逐渐缩短,但卵、第1若螨和第2若螨的发育历期在各代之间无显著差异。在F₂, F₄和F₆代之间,草栖钝绥螨的存活率和种群参数无显著变化;种群参数中,不同饲养代数的内禀增长率(r)和周限增长率(λ)分别为0.19~0.20和1.21~1.22/d。F₂, F₄和F₆代草栖钝绥螨雌成螨对二斑叶螨若螨和雌成螨的捕食量无显著差异,其捕食功能反应均符合HollingⅡ型。【结论】以贝氏小奥林螨为替代猎物时,草栖钝绥螨能正常发育和繁殖,其种群数量呈增长趋势。本研究表明贝氏小奥林螨可以作为草栖钝绥螨人工饲养的潜在替代猎物。     

灌溉施肥水平对盐渍化农田水盐分布及玉米产量的影响

水资源缺乏和过量施肥影响着干旱半干旱盐渍化地区农业的发展.研究不同灌溉和施肥量对土壤水盐分布和青贮玉米产量的影响,可为该区确定适宜的灌溉和施肥量提供依据.试验于2015和2016年在大同盆地的盐渍化农田进行,设3种灌溉水平:土壤水分上限分别为田间持水率(θ_f)的100%(W₁)、90%(W₂)和80%(W₃),根据各处理灌溉前的土壤平均实际含水率计算灌水量;2015年设4种施肥水平:900(F₁)、750(F₂)、600(F₃)和450 kg·hm^-2(F₄),2016年设F₁、F₂和F₃共3种.试验用化肥为缓释复合肥,总养分含量48%,其中N:P₂O₅:K₂O的比例为30:12:6.结果表明: 土壤表层电导率随施肥量的增加而增大,施肥水平对平均电导率(EC)和含水率的影响在0～10 cm土层显著,与F₁相比,F₂的0～10 cm土层平均EC在2015年和2016年分别降低25.6%～42.7%和6.4%～7.7%.20～80 cm土层的水分含量随施肥量的增加而降低,与F₁相比,2015年F₂、F₃和F₄处理20～80 cm土层平均土壤含水率分别增加5.9%、16.7%和16.7%,2016年F₂和F₃分别增加13.3%和16.7%.产量在两年中均表现为F₁和F₂高于F₃和F₄,W₃低于W₁和W₂; F₁和F₂的产量差异不明显;与W₁相比,W₂的产量减少低于15 %.因此,施复合肥600～750 kg·hm^-2(氮肥含量180～270 kg·hm^-2),且灌溉水平为W₁和W₂时,可以保证该地区盐渍化土壤种植玉米获得较高的产量,并且不会造成根系层的盐分积累.     

人染色体的银染与G带的复合显示方法

自Goodpastur。等^[3]建立染色体的银染色方 法以来,该技术已在细胞遗传学的各个领域得 到广泛的应用,被认为是研究18S-28S rDNA 的分布与转录的一种简易而有效的方法^[4]。银 染技术可以特异性地使核仁组织者区（NOR) 着色（称之Ag-NOR),其银染位置与染色体上 核糖体基因(rDNA）的分布相一致^[10]     

枣JMS2×交城5号F1代糖酸组分遗传变异分析

探索枣杂交F₁代果实糖酸组分性状遗传变异规律,将为枣杂交育种亲本选配和优异种质筛选提供理论依据。本研究以枣JMS2×交城5号的140株F₁代及亲本为试材,利用高效液相色谱(HPLC)测定杂交果实糖组分和酸组分的含量。结果表明：杂交后代果实中糖主要是由蔗糖、果糖、葡萄糖组成,其中蔗糖占比52.5%。糖组分变异系数范围为26.74%～35.45%,其中葡萄糖变异系数最大,蔗糖变异系数最小。果糖、葡萄糖的F₁均值大于中亲值,蔗糖则低于中亲值。酸主要由苹果酸、奎宁酸和柠檬酸组成,其中苹果酸占比35.10%。酸组分的变异系数范围为29.67%～42.86%,苹果酸F₁均值小于中亲值,草酸和富马酸的F₁均值高于中亲值,其他酸组分受环境影响较大。糖组分、酸组分均呈现出正态分布特征,均是由多基因控制的数量性状。筛选出高糖杂交优系J17和J70。     

L615小鼠中期染色体的银染研究

对人和动物细胞的中期染色体的核仁形成 区（NOR,）用硝酸银试剂进行特异性染色（下 称银染技术）,已由Denton^[4]和Goodpasture^[5]等 人证明,被银染的物质是一种酸性蛋白质成分。 银染能够显示核糖体基因18S和28S在染色体 上的位置以及在细胞周期中的活动^[7]。染色体 银染技术的出现,为细胞学研究提供了新的手 段,其应用范围已经扩及到人和动物的体细胞、 生殖细胞以及培养细胞等各个方面。     

谷蠹和米象对磷化氢抗性遗传的研究

本文就谷蠹Rhyzopertha dominica 和米象Sitophilus oryzae对磷化氢的抗性遗传进行了研究,分别对两个种的实验室敏感品系和粮仓现场采集的抗性品系作为亲本进行杂交。同时测定了各自的亲本及其F₁杂种、F₁对抗性亲本回交和F2混交后代的剂量-死亡率反应曲线,并对它们的结果进行了遗传分析。结果指出,谷蠹和米象的F₁杂种对磷化氢的抗性遗传都为不完全隐性,各自的显性度(D)分别是-0.768和-0.348。同时F₁,回交和F₂混交的观察值和计算值之间的X²分析也表明,抗性表现为一个以上的常染色体因子遗传,但是主要是受隐性因子所控制。     

水稻核不育系4个柱头性状的遗传分析

为改良水稻(Oryza sativa)核不育系柱头性状提供遗传信息, 调查了粳型核不育系7001S、籼型核不育系Z913S及其杂交、自交获得的F₁、F₂和F_2:3群体的4个柱头性状, 分析了4个性状间的相关性, 并利用主基因+多基因遗传模型对2个世代4个性状进行遗传分析。结果表明, 4个性状两两间呈极显著正相关, 相关系数介于0.274-0.897之间。除F_2:3群体中花柱长度和柱头外露率分别表现出受2对加性-显性主基因和1对负等效加性-显性主基因+多基因控制外, F₂和F_2:3群体的柱头长度、花柱长度、柱头-花柱总长度以及柱头外露率均表现出受2对主基因和多基因控制, 且F_2:3群体中控制花柱长度的主基因表现出加性-显性效应, 其余均表现出加性-显性-上位性效应。2个世代中4个性状均以主基因遗传为主。     

甲氰菊酯和阿维菌素对柑橘全爪螨的亚致死效应

通过叶碟饲养的方法, 利用生命表技术,研究了甲氰菊酯和阿维菌素亚致死剂量LC₂₀处理柑橘全爪螨若螨后,对试验种群当代(F₀)和后代(F₁、F₂代)生长发育及繁殖的影响.结果表明: 甲氰菊酯LC₂₀处理若螨后,当代雌成螨产卵量显著增加;F₁、F₂代的产卵前期缩短,后代雌性比例增大,且均与对照差异显著;同时,F₁和F₂代种群内禀增长率(r_m)和周限增长率(λ)增大,世代历期(T)和种群加倍时间(Dt)缩短,且F₂代与对照相比差异显著.用阿维菌素LC₂₀处理若螨后,当代种群雌成螨产卵量显著下降; F₁和F₂代的产卵量也显著下降,但后代雌性比例增大,产卵前期显著缩短;F₁和F₂代的种群r_m和λ增大,T和Dt缩短,且F₂代比F₁代更为明显.总体来看,甲氰菊酯和阿维菌素亚致死浓度LC₂₀对柑橘全爪螨的影响并不完全相同,甲氰菊酯能够促进当代种群的发展,而阿维菌素对当代种群有一定的抑制作用;但两种杀螨剂亚致死浓度处理柑橘全爪螨对后代种群都有一定的促进作用.研究结果对柑橘全爪螨综合防治策略的制定有一定的指导意义.     

华南鲤选育群体不同世代遗传多样性与遗传结构的微卫星分析

为了解人工选育对华南鲤(Cyprinus carpio rubrofuscus)选育群体遗传结构的影响, 采用微卫星技术分析了华南鲤4个连续选育世代(F₁、F₂、F₃和F₄)的遗传多样性和遗传结构。结果显示:在4个选育群体中, 16对微卫星引物共扩增得到99个等位基因, 每个微卫星座位检测到的等位基因数为3—10个, 平均为6.1875个。随着人工连续选育的进行, F₁到F₄的平均等位基因数(N_a)从5.6875下降到4.6755, 平均观测杂合度(H_o)从0.7943下降到0.7135, 平均多态信息含量(PIC)从0.6577下降到0.5834。F₁与其后各代的遗传距离逐代增加(从0.1486上升到0.2181), 遗传相似系数逐代减小(从0.8619下降到0.8041), 而相邻世代间的遗传分化指数(F_st)逐代变小(F₁与F₂为0.062, F₂与F₃为0.058, F₃与F₄则为0.051), 遗传相似性逐步升高。世代间F_st值配对比较结果显示4个世代间的遗传分化处于中等水平, 表明人工选育已对华南鲤选育群体的遗传结构产生了影响。实验结果表明, 华南鲤经过4代选育后, 虽然遗传杂合度和遗传多样性存在下降的现象, 但遗传多样性水平依然较高, 还具有进一步选育的潜力。研究结果为下一步制定华南鲤新品种选育计划提供基础遗传数据。     

四倍体小麦背景中长穗偃麦草E染色体传递特征

通过细胞学方法和染色体特异分子标记鉴定六倍体小偃麦(AABBEE)与硬粒小麦(AABB)杂交的自交后代F₂和F₃植株,探讨长穗偃麦草染色体在硬粒小麦背景中世代间的传递特征,并筛选硬粒小麦-长穗偃麦草E染色体附加系。对218个F₂单株染色体数检测表明,2n=28植株占41.7%,2n=29植株占18.3%,其余40.0%植株的染色体数在2n=31~42范围内。分子标记鉴定表明,在F₂代2n=29单体附加植株中,不同的长穗偃麦草染色体传递率之间存在明显差异,1E传递率最高,3E和6E传递率最低。在F₂代2n=30单株中,1E、4E、7E和5E染色体相互组合产生的双单体多,6E参与组合较少,未检测到2E或3E与其他染色体的组合单株。在1E~7E单体附加株自交后代F₃中,E染色体传递率变化范围为9.1%~27.5%,1E传递率最高,6E传递率最低,与F₂的传递率一致。从F₃代中选育出1E~7E单体附加及少数二体附加,所有单体附加均可育。这些附加E染色体材料将对小麦代换系和易位系的创制提供有益的中间材料。     

玉米CMS-C同质异核不育系育性恢复的遗传研究

玉米是最早利用细胞质雄性不育系生产杂交种的作物之一,C型细胞质雄性不育系（C-type cytoplasmic male sterile, CMS-C）在杂交种生产中具有重要的作用,育性恢复的稳定性直接影响其应用价值。然而,玉米CMS-C的育性恢复机理复杂,且至今仍不明确。为进一步探究玉米CMS-C育性恢复的影响因素,本研究以玉米CMS-C同质异核不育系C48-2、C黄早四和C478为母本,分别与测验系18白、自330、5022以及恢复系A619组配杂交获得F₁。其中育性恢复F₁通过自交获得F₂,并以育性恢复F₁为父本分别给育性保持F₁授粉,组配双交群体,共获得4个F₂群体,6个双交群体。同时以不育系C48-2、C黄早四和C478为母本,各自的保持系48-2、黄早四和478为父本杂交组配不完全双列杂交F₁。将所有杂交组合的F₁、F₂以及双交组合群体分别在不同年份不同地点种植观察,通过植株田间育性调查并结合室内花粉镜检鉴定育性表现。结果表明：1) 同一测验系对玉米CMS-C同质异核不育系的恢保关系不同,暗示不育系的核背景参与调控育性恢复表现;2) 在不同年份不同地点对(C48-2×A619) F₂群体进行种植观察,发现不同环境下F₂群体可育株与不育株的分离比均符合15∶1,但在云南种植的可育株的育性级别主要为Ⅲ和Ⅳ级,而在四川种植的可育株的育性级别主要为Ⅴ级,表明环境对恢复系A619恢复后代的育性表现有影响;3) 通过恢保关系测定发现18白不能恢复C478,48-2也不能恢复C478,但双交群体[(C478×18白) F_1S×(C48-2×18白) F_1F]后代却出现了可育株与不育株的分离;同理,双交群体[(C48-2×自330) F_1S×(C478×自330) F_1F]的后代也出现了可育株与不育株的分离。因此,本文推测C48-2、C478核背景中存在微效恢复基因,这些微效基因与18白、自330中的微效恢复基因通过杂交聚合后能使C478、C48-2的育性恢复,暗示玉米CMS-C的育性恢复呈现一定的剂量效应。这些结果为进一步认识玉米CMS-C育性恢复的复杂性和多样性奠定了基础,为深入研究玉米CMS-C育性恢复机理以及加快CMS-C在不育化制种中的应用提供重要参考。     

小麦幼胚培养再生植株第二代若干性状的变异*

再生植株第二代（R₂）各性状如F₂代一样均表现为介于双亲的连续变异,并有超亲遗传。各性状的变异幅度均大于F₂代,超出F₂变异范围的株率依性而有所不同,从1.64——65.3%。R₂代各性状的遗传力较F₂有较大的提高。这些都反映了经体细胞培养后诱导了变异,丰富了R₂的遗传基础。     

LB技术获得的科间植物[烟草（＋）菠菜]F2、F3代植株与亲本呼吸代谢途径及叶绿素含量的遗传分析

本文报道了通过人工技术(LB技术）促使不同植物细胞间细胞质和染色质穿壁转移获得的科间植物[烟草（十）菠菜]F₂代植株与其双亲同一生长发育时期叶片的呼吸代谢途径及F₂、F₃代植株单位叶面积叶绿素含量的测定及比较分析,为LB技术导人外源遗传物质并使之遗传和表达从而获得杂种的真实性提供了佐证。     

遗传学实验

（十六）哺乳动物染色体的银染法实验原理 银染法（Ag-As技术）专染哺乳动物染色体上的核 仁组成区（nucleolar organizer region, NOR)。已知哺 乳动物中编码18S rRNA, 28S rRNA的基因（rDNA）是 位于特定染色体的核仁组成区。当用银染法染色时, rDNA能选择性地还原银,呈深黑色,染色深黑的可染 区即为核仁组成区（Ag-NORs )。可染区的数目反映了 有转录活性的核糖体RNA基因的数目。