人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

人白细胞介素26的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

克隆人白细胞介素-26(human interleukin-26,hIL-26)基因,构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。对GenBank上报道的hIL-26基因进行序列分析后设计合成引物,利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA中反转录并扩增得到人成熟肽IL-26基因。将得到的基因克隆到pMD18-T载体中,菌落PCR筛选、酶切鉴定并进行DNA序列分析。用BamHI和EcoRⅠ将目的片段切下,插入表达载体pBV220相应的位点。42℃热诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的20%,Western印迹法证实重组蛋白为特异性蛋白,分子筛纯化后纯度达90%以上。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测复性的重组蛋白能促进PBMC合成IFN-γ。     

人Leptin的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用 RT- PCR自脂肪细胞 RNA扩增人瘦素 (leptin)基因的 c DNA片段 (约 50 0 bp)并克隆至克隆载体 p SK(+) ,获得重组质粒 p SK- OB,DNA序列分析显示获得的 Leptin基因和文献报道一致 .用限制酶 Eco R 和 Bam H 从 p SK- OB切下并插入原核表达载体 p BV2 2 0的相应限制酶位点 ,转化大肠杆菌 DH5α.转化菌株经 42℃诱导 ,SDS- PAGE检测和 Western印迹鉴定 ,获得高水平重组人瘦素的表达菌株 ,其表达量达菌体总蛋白的 30 %以上 .     

重组人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx—BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83％的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

大鼠OB基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＲＴＰＣＲ技术扩增大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列。ＰＣＲ产物酶切后定向克隆至ｐＵＣ１９质粒。经核苷酸序列测定表明与文献报道的大鼠ＯＢｃＤＮＡ编码区序列一致。继之构建了ｐＢＶ２２０ｒＯＢ表达质粒并获得了ＯＢ基因在大肠杆菌中的特异表达。大鼠ＯＢ基因产物的获得为研究肥胖与某些非传染性疾病（如糖尿病、高血压病）间的关系提供了条件     

抗菌肽CPIOA在大肠杆菌中的融合表达

CPIOA是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造,且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。研究根据已报道的CP10A氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计CP10A的核苷酸序列,利用PCR技术合成相应的DNA序列,后克隆构建重组表达载体pET32a（＋）-CP10A,转入大肠杆菌AIM94菌株。经IPTC诱导表达和15％SDS—PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在,且融合表达量占总蛋白的50％。在变性条件下经Ni—NTA亲合柱层析及复性,最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。研究首次实现了CPl0A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达,为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达何晓龙,路长林,王成海（第二军医大学神经生物学教研室,上海２００４３３）关键词神经营养因子;基因克隆脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｉｃ…ｉ。血。ｔｏｒ,ＢＤ贾助是Ｂａｄｅ等人...     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β2-微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物,利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β2m基因,并构建了成熟β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

人APRIL105-250基因的克隆与表达

目的 :克隆并表达人可溶性增殖诱导配体 (sAPRIL ,即人APRIL_105-250) ,为探索其在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用奠定基础。方法 :从GENBANK中查找人APRIL蛋白 (编号:07588)序列 ,取其部分胞外 (APRIL_105-250)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人APRIL_105-250基因 ,测序后将克隆载体经酶切并构建表达载体 ,在大肠杆菌中表达 ,并纯化蛋白。结果 :经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为人APRIL_105-250 基因。在大肠杆菌中表达量达 43.6% ,获得纯化蛋白。结论 :成功克隆与表达、纯化了人APRIL_105-250基因 ,为深入研究其功能奠定了基础 。     

人白细胞介素22基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

白细胞介素 2 2 (ＩＬ 2 2 )是 2 0 0 0年发现的一种新的人类细胞因子 ,它在多种组织中均有表达 ,包括胰腺、脑 ,肝、小肠、直肠和肾等 .在功能方面 ,ＩＬ 2 2上调肝细胞急性期产物 ,参与炎症反应[1～ 3] ;诱导胰腺相关蛋白ＰＡＰ1 Ｒｅｇ2和ＯＰＮ的高表达 ,表明ＩＬ 2 2参与胰腺免疫功能反应[4 ] ;它对ＣｏｎＡ刺激下Ｔｈ1细胞ＩＦＮ γ的产生没有明显的抑制作用 ,却大大抑制了Ｔｈ2细胞ＩＬ 4的分泌 ,这对于哮喘有潜在的治疗作用[1] .我们利用反转录ＰＣＲ获得了编码ｈＩＬ 2 2成熟蛋白的ｃＤＮＡ ,并构建了高表达载体ｐＢＶｈＩＬ 2 2 ,…     

小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

人白介素6受体功能区片段在E．coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ的ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３。重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＬ－６Ｒ的抗原性。     

内皮素A型受体胞内区在大肠杆菌中的表达及其纯化

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,将内皮素Ａ型受体（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎｔｙｐｅＡｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＥＴＡＲ）胞内区ｃＤＮＡ克隆到ｐＵＣ１８载体中进行序列分析。结果表明,ＤＮＡ序列与预期结果完全相符。然后用低熔点琼脂糖回收插入到ｐＵＣ１８载体中的ＥＴＡＲ胞内区ＤＮＡ片段,连接到ｐＧＥＸ２Ｔ融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游,转化大肠杆菌ＪＭ１０３,得到的重组质粒命名为２Ｔ／ＥＴＡＲ。ＪＭ１０３（２Ｔ／ＥＴＡＲ）经３０℃培养、ＩＰＴＧ诱导明显表达出ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在。包涵体经变性和复性后,用亲和层析一步纯化法获得了较纯的ＥＴＡＲ胞内区融合蛋白,为进一步研究ＥＴＡＲ胞内区的功能打下了良好的基础     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。