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为了将外源基因导入花椰菜原生质体获得转基因植株,本文研究了PEG介导的外源基因在花椰菜下胚轴原生质体中的瞬间表达。(1)20%PEG将质粒pBI221导入原生质体后GUS表达比13%PEG导入的高,但易造成原生质体损伤。(2)热激处理增强表达,但在随后的培养过程中易造成原生质体降解。(3)原生质体状况对表达有重要影响,5d龄下胚轴原生质体比8d龄的表达强。(4)不同质粒及启动子表达强度不同。质粒pKIWI101比pBI221表达强3倍左右。 相似文献
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PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株 总被引:3,自引:0,他引:3
采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料,分离原生质体,在原生质体培养基中作液体浅层暗培养,植板率为5%,植株再生频率为100%。作者进而开展了遗传转化研究。为研究PEG介导转化诸葛菜原生质体的影响因素,通过瞬间表达,实验了PEG法转化子叶原生质体的过程,在此基础上将分离纯化后的原生质体与带HPT基因的质粒DNA(pBI222)混合,HPT基因作选择标记,PEG介导转化;重新收集转化后的原生质体,以5×104/ml的密度在原生质体培养基中作浅层培养;培养10—15天后用25mg/L的潮霉素(hygromycin)进行筛选,一月后出现少量细胞团,转入含潮霉素50mg/L的扩增培养基扩增愈伤组织,进而转入含50—100mg/L潮霉素的分化培养基诱导分化成苗,分化率为100%,转入生根培养基中生根成完整植株。抗性植株再生率为4×10(-5)。在获得再生转基因植株后,以再生植株叶片为材料,进行Southernblot分子杂交,证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达,再生转基因植株频率为10(-5)。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。 相似文献
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猪生长激素基因表达质粒的构建及其转基因动物研究 总被引:3,自引:0,他引:3
将猪生长激素基因(PGH)克隆到质粒pUC19上,经酶切分析,确定其酶切图谱。把PGH转录起始位点以前的序列切掉,换上羊MT-1a基因的启动子,构建成可以调控的表达载体pSMTPGH,用于转基因动物的研究。采用微注射法将线状pSMTPGH导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物。对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这3种动物中的整合率均在9%以上,其生长速度都 相似文献
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日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
研究了外源基因日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)在卡介苗(bacilusCalmete-Guerin,BCG)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和大肠杆菌(E.coli)中的表达.运用重组DNA和聚合酶链反应(PCR)等分子生物学技术,以表达Sj26GST的E.colipGEX衍生质粒为模板,经PCR得到编码Sj26GST的全长cDNA片段.将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70的启动子下游,再将HSP70启动子和Sj26GST基因一起亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,得到E.coli-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26.pBCG-Sj26电转化入BCG和M.smegmatismc2155中表达Sj26GST抗原,所表达的天然重组Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带.其表达量分别占BCG和M.smegmatis菌体总蛋白的15%和10%.可见,Sj26GST基因能在BCG中高效表达. 相似文献
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将猪生长激素基因(PGH)克隆到质粒pUC19上,经酶切分析,确定其酶切图谱.把PGH转录起始位点以前的序列切掉,换上羊MT-1a基因的启动子,构建成可以调控的表达载体pSMTPGH,用于转基因动物的研究.采用微注射法将线状pSMTPGH导入猪、鼠和金鱼的受精卵中,得到了相应的转基因动物.对这些动物鉴定分析表明,外源基因整合率因动物不同而异,但该基因在这3种动物中的整合率均在9%以上,其生长速度都高于对照组. 相似文献
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用聚合酶链式反应(PCR)从HIV 1gag基因中扩增出衣壳蛋白P24截短体(tP24)基因,插入质粒pGEX 4T3中构成重组表达质粒pGEX tp24,将pGEX tp24转化大肠杆菌BL21后获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白量的3438%。经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化的截短体P24纯度为9277%。纯化的截短体P24在间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清中,具有很高的抗原特异性和免疫反应性。 相似文献
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HSP70基因上游调控序列对GST基因在耻垢分枝杆菌中表达效率的
影响 总被引:1,自引:1,他引:0
将外源基因———日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)基因克隆到大肠杆菌分枝杆菌穿梭质粒中,构建成四个不同的表达截体,研究它们在耻垢后分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)中的表达效率。首先将含有结核杆菌热休克蛋白70(HeatShockProtein,HSP70)的启动子的质粒pMT70用NcoI切,进行两种不同的修饰后,得到不同的SD序列;将Sj26GST基因克隆进去。再将含HSP70启动子和Sj26GST基因的片段切下,克隆到分枝杆菌大肠杆菌穿梭质粒pBCG2000中,筛选出不同SD序列、不同方向和不同拷贝数的分枝杆菌表达载体四个。所表达的重组天然Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDSPAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带。通过薄层扫描分析,发现表达质粒中双拷贝启动子外源基因组合,表达效率最高,是单拷贝组合的16倍,占分枝杆菌菌体总蛋白的28%。而不同的克隆方向和不同的SD序列(两者相差3个碱基)对表达效率的影响不明显。 相似文献
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将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒。体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质闰可表达RNA聚合酶。将PV的5’NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5’NCR质粒; 相似文献
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表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免?… 总被引:11,自引:0,他引:11
将将城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pEGF1175-1的P7.5启动子下游,得到转移载体pFG1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SF 相似文献
11.
应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达 总被引:4,自引:0,他引:4
为了观察硫氧还蛋白(TrxA)促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒pET-32a(+)上克隆了trxA基因,构建了TrxA表达质粒pT-TrxA。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化E.coli并同时获得表达。结果表明,共表达TrxA可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、PTHrP受体(PTHrP-R)的血管内皮生长因子(VEGF)的可溶性表达。说明共表达 相似文献
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紫云英细胞转化条件的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
研究了紫云英(AstragalussinicusL.)细胞遗传转化的条件。根癌农杆菌(Agrobacteriumtum efaciens)经含乙酰丁香酮的低pH/PO3-4 诱导培养后,用来感染紫云英下胚轴原生质体,随后的细胞GUS瞬间表达活性显著提高,间接证明了上述预培养诱导活化了细菌vir基因,促进了T-DNA 向植物细胞转移。在PEG介导的DNA 转移中,较高的pH 和Ca2+ 浓度能够提高细胞GUS活性。质粒DNA 浓度及启动子类型对外源基因在植物细胞内表达也有一定影响。采用外植体-农杆菌共培养法,获得GUS和NPT Ⅱ基因稳定表达的紫云英转化植株 相似文献
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碱性蛋白酶基因在Bacillus licheniformis 2709中的整合和扩增 总被引:2,自引:0,他引:2
将含有去掉启动子的枯草杆菌碱性蛋白酶基因和Cm抗性基因的整合质粒pMP以原生质体PEG法转化B.licheniformis2709在10u/mlCm平板上筛选整合子,并通过不断提高整合子的抗氯霉素能力来扩增染色体碱性蛋白酶基因,最终选到一株产酶比生产菌2709提高60%的高表达整合菌BL-203,该菌在无选择压力下遗传性状相当稳定。 相似文献
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应用多聚酶链反应(PCR),直接从SIV感染的猴艾滋病(SAIDS)模型猴的外周血淋巴细胞总DNA中扩增出767bp的SIV核心蛋白P27基因片段。扩增产物经EcoRI及SalI双酶切后,克隆入相同酶切的表达质粒pBV220中,获得含SIV核心蛋白基因片段的重组质粒pBVSG,并进行DNA序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌DH5a经筛选、增殖及42℃温度诱导,SDS-PAGE表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白14.5%,Western-blot证实表达产物能被SIVP27单克隆抗体及SAIDS模型猴血清中特异性抗体识别。 相似文献
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在克隆和鉴定新城疫病毒(NDV)F48E8株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175-1中启动子P7.5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175-1。将此质粒pFGHN1175-1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3 ̄4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV-HN基因特异 相似文献
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霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)的克隆及其表达 总被引:7,自引:0,他引:7
从霍乱弧菌中抽提基因组DNA,用PCER方法获取霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)。序列分析结果表明,CtxB基因编码124个氨基酸,其中编码62位Thr的密码子与文献报道有差异。将CtxB基因插入质粒pGEX-4T-2,构建pGEX-CTXB表达质粒,转化大肠相菌BL21(DE30,筛选表达菌株CTXB/BL21。工程株经IPTG诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经SDS-PAGE分析,融合蛋白分子 相似文献
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特异性向肝细胞表达和复制的EB病毒载体系统的组建 总被引:2,自引:0,他引:2
发展了一种高效的、能将推带外源基因的质粒型EB病毒载体特异性导入肝细胞表达的方法,将EB病毒复制子载体pDR2经改造得到携带外源基因的pEBluc质粒,将pEBluc与人工制备的、既保留了DNA结合活性又有为为肝细胞受体识别并内在化的半乳糖基化组蛋白的fl组分结合形成pEBluc-半乳糖基化组蛋白复合物。该复合物通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞进入肝并表达。pEBluc质粒在细胞内能稳定存在并自主 相似文献
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以 P R R S V 弱毒株膜蛋白( M) 和核衣壳( N) 蛋白基因为模板,设计的一对含有 Eco R I 和 Bam H I酶切位点的引物,通过 R T P C R 扩增出一约900 bp 的 M N 基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体p B V220 ,构建成重组质粒p B V M N,导入大肠杆菌 D H5α,经温敏诱导,成功地表达了 M N 基因。表达产物经 S D S P A G E 电泳和 Western blot 印迹分析,其分子量约34 k D,与兔抗 P R R S V 高免血清发生反应,经光密度扫描分析,表达产物量占菌体总蛋白的12 % 。该研究为 P R R S 基因诊断抗原的研制奠定了基础 相似文献
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人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 总被引:11,自引:2,他引:9
将人p53 基因装入 Pichia 分泌型质粒p H I L S1 中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经筛选得到一高表达p53 蛋白的克隆。 S D S P A G E 显示表达量约占分泌总量的30 % 。 E L I S A 验证重组人p53 存在免疫学活性。在诱导时就降低 Pichia 酵母系统水解酶活力等方面进行优化,经 F P L C 分离纯化得到约200 m g/ L 表达量。 相似文献