嗜水气单胞菌铁载体的提纯及特性分析

提纯了嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ１ 株的铁载体（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ） ,并对其特性进行了初步分析。Ａｈ Ｊ１ 株的培养上清液经聚酰胺柱层析、双蒸水洗脱、乙酸乙脂沉淀和真空冻干,获得白色粉末。用ＣＡＳ法及Ａｒｎｏｗ 法检测均为阳性,证实为铁载体,含有２ ,３二羟基苯甲酸（２ ,３ＤＨＢ） 功能团,属酚盐类铁载体。高压液相色谱分析表明,此种铁载体仅含甘氨酸、赖氨酸及色氨酸。上述纯化的铁载体,在体外培养条件下能促进产铁载体为弱阳性的Ａｈ Ｎ９ａ 株的生长,且能对抗ＥＤＤＡ 对细菌生长的抑制作用,显示铁载体能促进细菌的增殖,在细菌的感染致病过程中可能起重要作用。     

嗜水气单胞菌S蛋白的提纯及特性分析

电镜观察表明,嗜水气单胞菌J-1株具有S层结构,在菌体外层呈晶格样规则排列。菌体经酸性甘氨酸缓冲液处理,S层从菌体上脱落,离心上清液即为粗提S蛋白。进一步经Sephadex G200凝胶层析和DEAE-纤维素离子交换层析纯化,获得的S蛋白呈单一多肽,分子量为51500。氨基酸组分分析结果表明,S蛋白含有天门冬氨酸等15种氨基酸,其中丙氨酸等疏水性氨基酸占36.8％。生物学活性显示,S蛋白对Vero细胞有轻微的细胞毒性,但没有溶血性,对鲫鱼和小鼠也无致死作用。用自制的嗜水气单胞菌J-1株S蛋白抗血清PM及PR和国外提供的嗜水气单胞菌TF7株S蛋白抗血清PF1分别作免疫转印和间接ELISA,检测来源于不同地区和不同动物种类的20株嗜水气单胞菌的S蛋白。结果表明,S蛋白的抗原性存在着菌株间的差异。另外,某些菌株不具有S层。     

嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析

目的调查湖州市中心医院嗜水气单胞菌感染现状和耐药情况。方法采用常规方法分离,用VITEK-32全自动微生物分析仪进行菌种鉴定为嗜水气单胞菌或豚鼠气单胞菌,依据葡萄糖产气反应鉴定为嗜水气单胞菌。并根据配套药敏卡进行药敏试验。结果共分离到34株嗜水气单胞菌,主要来自痰液、胆汁、腹腔引流液或腹水。嗜水气单胞菌对哌拉西林、替卡西林、阿莫西彬克拉维酸、妥布霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明耐药率为52．9％～73．5％。结论目前嗜水气单胞菌也呈现多重耐药现象,临床上应予以重视。     

嗜水气单胞菌毒素的提纯及其特性分析

从患发性传染病的家养鲫鱼分离到嗜水气单胞菌,其培养物经硫酸铵沉淀,DEAE-纤维素层析及Sephadex G100凝胶过滤纯化,获碍一种单一多肽的外毒素,分子量为52.5kd。该毒素对热敏感,对胰酶有抗性,最适pH5—8,具有溶血性、肠毒性和细胞毒性,腹腔注射致死小白鼠和鲫鱼．其生物学活性可被同源抗毒素中和。鉴于该毒素的独转性质,建议命名为hec毒素。     

嗜水气单胞菌cpxRA缺失株构建及生物学特性研究

为了探讨Cpx系统在嗜水气单胞菌生长及毒力等方面发挥的作用, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀质粒pRE112为载体构建缺失57—1879 bp序列的cpxR-A基因簇突变株 Δcpx, 然后比较缺失株和野生株在生长、生物膜形成、应激耐受及毒力等生物学特性方面的差异。普通PCR及荧光定量PCR结果验证了突变株中cpxRA基因簇片段的部分缺失, 表明突变株构建成功; 生物学特性研究结果显示, 突变株在形态、生长、生物膜形成及毒力等方面与野生株没有显著差异, 两者主要在应对高渗透压、SDS (十二烷基磺酸钠)刺激及含有EDTA (乙二胺四乙酸二钠)或多黏菌素B环境表现不同。结果表明Cpx双组分系统在嗜水气单胞菌应对外界刺激方面扮演着重要角色, 但在毒力方面则可能处于次要地位。     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

嗜水气单胞菌脂酶同工酶提取方法的研究

采用了5种提取方法对嗜水气单胞菌酯酶同工酶进行酶样品提取，并对提取温度以及提取时冻存时间等条件进行了摸索。结果表明：以TBE冷没法，-20℃冻存18～24h的提取条件最适用于嗜水气单胞菌酯酶同工酶的提取，且方法简便，值得推广。     

鲟源致病性嗜水气单胞菌X1的分离鉴定与药敏特性研究

从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1,其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105CFU/mL,具有较强毒力;菌株X1为革兰氏阴性杆菌,菌体大小为1.0μm～1.2μm×2.1μm～2.4 μm,周生侧鞭毛,在兔血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈,经ATB细菌鉴定仪鉴定和16S rDNA序列分析,菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)(登录号:EU669667);其系统发育分析表明,菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号:X74676.1)的亲缘关系最近,其同源性为99%.此外,菌株X1对先锋必、左氟沙星等2种药物高度敏感,对妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、庆大霉素、复达欣、万古霉素、新霉素、多粘菌素B,洛美沙星等10种药物中度敏感.     

蟹组织中致病性嗜水气单胞菌的分离及其特性

1999年 6月从江苏省启东市某水产养殖场患病濒死的中华绒螯蟹肝胰腺中分离出 3株致病菌。经回感实验证实了菌株在 2 4h内对健康蟹的致死率分别为 10 0 %、75 %和 6 0 % ,回感温度升高可导致死亡时间缩短。经细菌形态、生理生化特性等鉴定为嗜水气单胞菌 ,分别定名为 ES- 1、ES- 2和 ES- 3菌株。3株菌的最适生长温度在 35℃ ,p H8,Na Cl浓度 0～ 1%。     

触组织中致病性嗜水气单胞菌的分离及其特性

1999年6月从江苏省启东市某水产养殖场患病濒死的中华绒螯肝胰腺中分离出3株致病菌,经回感实验证实了菌株在24h内对健康触的致死率分别为100%、75%和60%,回感温度升高可导致死亡时间缩短,经细菌形态,生理生化特性等鉴定为嗜水气单胞菌,分别定名为ES-1、ES-2和ES-3菌株。3株菌的最适生长温度在35℃,pH8,NaCl浓度0-1%。     

Cloning and characterization of an extracellular temperature-labile serine protease gene from Aeromonas hydrophila

Aeromonas virulence is thought to depend on multigenic functions. The gene for an extracellular protease from Aeromonas hydrophila SO2/2 was cloned in Escherichia coli C600-1 by using pIJ860, bifunctional plasmid, as a vector. The gene encodes for a temperature-labile serine protease (P2) with a molecular mass of approx. 68 kDa which is highly inhibited by PMSF. The gene was expressed in Streptomyces lividans 1326 by transforming protoplasts with the original clone pPA2. We were also able to transfer and express the prt P2 gene in Pseudomonas putida by mating experiments. The protein P2 was secreted into the periplasms of both P. putida and E. coli C600-1 being identical in properties to one of the proteases secreted into the culture supernatant by A. hydrophila SO2/2.     

细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行有效脱色的脱色酶,命名为TpmD。该酶的亚基分子量为29.4kDa,等电点为5.6。该酶催化上述4种三苯基甲烷类染料脱色反应的适合温度为40~60℃,适合pH范围为5.5~9.0。动力学参数测定结果显示TpmD对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿的Km值分别为24.3、40.65、4.2、68.5μmol-1.L-1,Vmax值分别为19.6、74.1、82.8、115.6μmol.L-1.s-1。结晶紫为该酶的最适反应底物。TpmD催化的脱色反应依懒于NADH/NADPH及分子氧的存在,显示该酶属于NADH/NADPH依赖型的氧化酶类。这是国内外首次关于细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶酶学性质的描述。     

细菌脱色酶TpmD的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行高效脱色的脱色酶,命名为TpmD。在测定TpmD分子量、等电点及对不同三苯基甲烷染料脱色的动力学参数、脱色过程对分子氧及NADH/NADPH具有依赖性的基础上,又进一步从黄素FAD/FMN对酶活力的影响、酶抑制剂、酶蛋白N-末端测序及酶溶液的特征吸收光谱等方面对TpmD的酶学本质进行了分析。结果表明,TpmD不含核黄素,其脱色活性也不因加入FAD或FMN而提高。TpmD的N-末端氨基酸序列与多种氧化还原酶具有同源性。甲吡酮及维生素C(Vc)对TpmD的脱色活性具有明显的抑制作用。TpmD酶蛋白的溶液在408nm处有一特征吸收峰,但在连二亚硫酸钠的还原条件下通入CO气体后,该酶却不具有P450酶在450nm处的特征吸收峰。上述结果显示脱色酶TpmD是一种新的氧化酶。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS－PAGE蛋白电泳表明在39．9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该39．9kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36．9kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为 疫苗的候选成份提供理论基础。     

嗜水气单胞菌RB5-M1的分离鉴定及脱色条件研究

【目的】筛选具有高效脱色活性黑5能力的菌株。【方法】利用梯度浓度驯化法,从上海松江污水处理厂的活性污泥中分离获得了一株具有良好脱色能力的细菌RB5-M1。【结果】经形态学观察、生理生化特性鉴定以及16S rRNA基因序列分析,发现该菌株与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源性达到99.86%。【结论】菌株RB5-M1在35°C、pH 8.0的条件下,厌氧条件培养(氮气85%、二氧化碳6%)24 h,测定的平均脱色率可达94.1%,最高脱色率为99.8%。     

Co-migration of RAPD-PCR amplicons from Aeromonas hydrophila

Random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) uses arbitrary primers and low stringency annealing conditions to amplify anonymous DNA fragments which are then depicted in agarose gels. RAPD-PCR fingerprints have been used for typing and differentiation of bacteria and, increasingly, for the study of genetic relationships between strains and species of microorganisms, plants and animals. The analysis of such fingerprints is based upon the assumption that co-migration of amplicons does not occur and that any given band contains a single amplicon. This report shows that co-migration of fragments of nearly identical size, but different nucleotide sequences, occurs between different isolates and within single RAPD-PCR bands from Aeromonas hydrophila. The possibility of the same phenomenon occurring for other prokaryotic or eukaryotic genomes argues for caution in the interpretation of RAPD-PCR fingerprints.     

嗜水气单胞菌BYKAH2008AC株外膜蛋白和溶血素双基因的融合表达及免疫原性分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的外膜蛋白基因(OmpTS)和溶血素基因(Hly)是其重要的保护性抗原。根据Genbank已发表的两个基因的序列设计引物,扩增其去除信号肽部分的基因片段,再将二者通过柔性片段融合,定向插入到质粒pET32a中构建重组融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得与预期大小108 kD相吻合的融合蛋白条带。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。ELISA和Western Blot检测该抗体效价为1∶4000以上,且该重组蛋白与抗OmpTS兔血清和抗Hly兔血清都呈阳性反应,表明该融合蛋白保留了外膜蛋白和溶血素的免疫原性,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。