利用RNA-seq技术筛选大白猪皮下和肌内脂肪组织差异表达基因

为了比较分析大白猪皮下和肌内脂肪组织的全转录组数据,探究调控脂肪沉积的分子机制,本文采用RNA-seq技术和生物信息学方法鉴定大白猪皮下和肌内脂肪组织基因表达谱,对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)分析、信号通路富集分析以及蛋白互作网络分析。大白猪皮下和肌内脂肪组织中有180个基因差异表达,上调基因主要参与细胞增殖、脂质激酶活性和磷脂代谢等与脂质代谢相关的生物学过程正调控,下调基因显著富集于脂肪细胞分化中起重要调控作用的MAPK信号转导通路。差异表达基因主要通过参与脂质代谢及通过MAPK信号转导通路调控脂肪细胞成脂分化,进而影响大白猪皮下和肌内脂肪的沉积。     

大白猪不同脂肪部位脂质代谢相关基因的表达差异分析

脂肪沉积决定于脂肪酸合成、转运和分解代谢的动态平衡。为比较猪(Sus scrofa domesticus)不同脂肪部位脂质代谢差异和不同性别间的差别,筛选与脂肪沉积能力显著关联的相关酶基因,本研究检测大白猪(Large White pigs)脂质代谢相关生化指标、肌内脂肪(intramuscular fat)含量,皮下脂肪、腹部脂肪和肾周脂肪组织间脂肪酸合成酶基因ACC,脂肪酸转运酶基因CPT1A和CD36,以及脂肪酸分解酶基因HSL和LPL的转录表达水平,分析目标基因与血清生化指标和肌内脂肪含量的相关性,比较在不同脂肪组织间的基因表达差异。结果表明,血清甘油三酯(triglycerides)、总胆固醇(total cholesterol)和肌内脂肪含量在不同性别大白猪中均无显著性差异(P>0.05)。相关性分析表明,大白猪公猪腹部脂肪中ACC基因表达量与甘油三酯含量呈显著正相关(P<0.05),皮下脂肪中HSL基因表达量与甘油三酯含量呈显著负相关(P<0.05);大白猪母猪腹部脂肪中ACC基因表达量与甘油三酯含量呈极显著正相关(P<0.01)。实时定量PCR结...     

沙子岭猪肝脏细菌和脂质图谱研究

近年来,有研究提示动物内脏组织含有少量细菌,它们参与了脏器组织生理代谢反应.本实验以成年沙子岭猪和大白猪为实验模型,比较了二者肝脏细菌组成以及脂质代谢图谱,并通过Pearson关联分析解析二者之间的互作关系. 16S rDNA测序提示,沙子岭猪和大白猪肝脏均含有一定丰度的细菌,且二者细菌组成存在明显差异.在门水平上,沙子岭猪肝脏变形菌门(Proteobacteria)和衣原体(Chlamydiae)丰度显著高于大白猪;在属水平, 14种细菌在沙子岭猪和大白猪肝脏存在显著差异.沙子岭猪和大白猪肝脏脂质组学筛选出37个差异代谢脂质,其中6个脂质在脂肪型沙子岭猪肝脏显著富集, 31个脂质在瘦肉型大白猪肝脏富集; Pearson关联分析证实,肝脏细菌可能参与脂质代谢,其中13种差异细菌与35种差异代谢脂质显著相关.综上所述,不同代谢类型动物模型肝脏细菌组成存在差异,且可能对脂质代谢具有重要的作用,并影响动物代谢表征.     

猪ATF4基因多态性与生产性状的关联及基因表达分析

为进一步了解和认识ATF4基因的功能,揭示ATF4对猪脂肪代谢的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用PCR方法扩增了ATF4基因部分序列,通过序列比对发现在翻译起始密码子ATG下游159 bp处存在A159G转换,通过PCR-AluⅠ-RFLP对大白猪、长白猪、梅山猪和通城猪进行酶切分型,发现在大白猪和长白猪中均为AA基因型,在梅山猪和通城猪中均为GG基因型。进一步对大白猪×梅山F2群体资源家系进行了酶切分型,并分析该位点的多态性与生产性状的关系。结果表明,ATF4的多态性与臀部平均膘厚存在极显著相关(P<0.01),与胸腰椎间膘厚、平均膘厚、眼肌高、眼肌面积存在显著相关(P<0.05)。采用Real-time PCR分析了ATF4基因在大白猪与梅山猪背最长肌不同发育阶段的表达模式。结果表明,ATF4基因在大白猪和梅山猪胚胎期65 d和出生后3 d中的表达水平相对都比较低,且在两品种间无明显差异;而在出生后60 d和120 d,ATF4基因在大白猪中与梅山猪均出现了上调表达,并且在梅山猪中的相对表达水平要显著高于大白猪。研究结果为进一步深入研究猪ATF4基因在脂肪代谢中的分子机理奠定了基础。     

不同猪种脂肪组织基因组DNA甲基化分析

本研究以典型的瘦肉型(杜洛克)和肥胖型(陆川)猪种为模型,利用新一代RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)技术研究两猪种脂肪组织基因组启动子及CpG岛(CpG Islands, CGls)的DNA甲基化差异。我们分别取得杜洛克、陆川样本中的Clean Reads 98720992、97254298,占各样品Reads的99.4%和99.56%;得到两样品中甲基化C位点(mC)中CG类型的甲基化所占比例最大;得到不同分布类型的mC差异;结果成功鉴定出两猪种脂肪组织基因组中的差异甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs),发现瘦肉型猪种(杜洛克)甲基化水平更高;共筛选出792个差异甲基化基因(differentially methylated gene,DMG),对其进行GO、KEGG富集分析,得到其主要影响intracellular part、binding和biological regulation等生物学过程,参与了endocytosis、MAPK signaling pathway和calcium signaling pathway等与脂肪代谢相关的通路。本研究探索了脂肪代谢的表观遗传调控机制,为优质、高效的猪肉生产提供参考数据。     

不同品种猪肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性分析

用PCR-RFLPs和PCR-SSCP分析方法,对"双肌臀”大白猪、大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏、皮特兰、二花脸、东北民猪、湖北白猪和部分杂交猪等不同品种猪肌肉生长抑制素基因3＇编码区、5＇调控区及内含子1区3个单核苷酸多态性位点(SNPs)进行了分析.结果表明,3＇编码区的SNP发生的频率较低,在274头猪中未检出突变纯合体.对5＇调控区的SNP,引进猪种(大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏和皮特兰)及其杂交猪以等位基因T为主,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01).东北民猪的3种基因型近乎相等,处于Hardy-Weinberg衡状态.对内含子1区的SNP,大白猪及其与长白猪的杂交猪等位基因G占优势,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01);东北民猪和大二猪的等位基因G和A近乎相等,处于Hardy-Weinberg平衡状态."双肌臀”大白猪在5＇调控区和内含子1区这两个位点的A等位基因稍高于普通大白猪.5＇调控区和内含子1区SNPs所产生的等位基因表现出连锁遗传现象.     

猪肌生成抑制素基因编码序列的分析

通过ＰＣＲ分段扩增出军牧１号白猪的肌生成抑制素基因编码序列１１２８ｂｐ,与国外猪种 同一基因的ｃＤＮＡ序列进行比较,仅在６３４ｂｐ处发生了由Ｔ替换Ｃ的变化,但对应的氨基酸没有变化,说明猪肌生成抑制素基因具有很高的保守性。     

猪CAST基因的单核苷酸多态性及其对肉质性状的效应

CAST基因作为肉质性状的主要候选基因.以80头外来猪和190头地方猪为材料,在CAST基因内含子24上检测到两个多态性位点(A916G 和C1633G ).在916位点上,长白猪和大白猪以A基因为优势基因,其频率分别为0.88和1.00;莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪以B基因为优势基因,其频率分别为0.93, 0.97, 0.78和0.68.在1633位点上,长白猪和大白猪以C基因为优势基因,其频率分别为0.82和0.79:莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪以D基因为优势基因,其频率分别为1.00, 1.00, 0.88, 0.78.在试验猪种中,共检测到6种单倍型(AACC,AACD,AADD,ABCC,BBCC,BBDD).单倍型分布的多重比较结果表明,外来猪种(长白猪和大白猪)与地方猪种(莱芜猪,大薄莲猪,沂蒙黑猪和里岔黑猪)比较差异极显著(P < 0.01).固定效应模型分析结果表明,嫩度,屠宰45 min后pH值和滴水损失单倍型间差异显著(P < 0.05).最小二乘分析结果表明,外来猪种与地方猪种在嫩度,屠宰45 min后pH值和滴水损失间差异显著(P < 0.05).BBDD单倍型个体与其它单倍型个体比较,嫩度及滴水损失差异显著(P < 0.05);AADD,BBCC,BBDD单倍型个体与其它单倍型个体比较,屠宰45 min后pH值差异显著(P < 0.05).因此,在育种过程中将CAST基因应用于标记辅助选择,将有利于改善猪肉品质,加快育种进程.     

猪PID1基因CDS区的克隆及其mRNA表达与肌内脂肪沉积关系

为了探索PID1(Phosphotyrosine interaction domain containing1)基因的表达与脂肪沉积的关系,文章利用兼并引物进行RT-PCR从猪脂肪和肌肉组织中克隆PID1基因CDS(Coding region)区全序列,并采用荧光定量PCR方法对大白猪、鲁莱黑猪、莱芜猪3个猪品种的肝脏、脂肪和肌肉组织PID1基因mRNA表达进行了相对定量分析。结果表明:经克隆、测序,得到了猪PID1基因654bp全编码区序列,通过Blast比对,与人、大鼠、牛有93.88%、66.94%、88.07%的同源性。PID1基因在同一个品种猪中mRNA表达水平总体表现为:肝脏脂肪肌肉。在不同品种3种组织中PID1基因mRNA表达水平总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪,其中肝脏中差异显著(P0.05),但是在脂肪和肌肉组织中莱芜猪与鲁莱黑猪差异不显著(P0.05)。对于高肌内脂肪(LWH)、中等肌内脂肪(LWI)和低肌内脂肪(LWL)沉积的3组莱芜猪,PID1基因在肝脏组织中的表达水平是LWH显著高于LWL(P0.05),在肌肉组织中则是LWH显著高于LWI和LWL(P0.05)。PID1基因在莱芜猪品种内3个组织中mRNA表达量与IMF含量相关均不显著,而在品种间3个组织中mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关(P0.05)。结果提示:PID1的表达可能与脂肪沉积性状存在一定的关系。     

SSH 法结合定量 PCR 技术研究双肌臀猪 肌肉组织的差异表达基因

利用抑制性消减杂交技术 (suppression subtractive hybridization , SSH) 成功地构建了双肌臀与非双肌臀大白猪肌肉组织差异表达的消减 cDNA 文库,获得有效克隆 686 个. 对整个文库测序分析,共获得 587 条有效序列. 利用 BLAST 在线软件与 GenBank、 GenBank EST 和 Tigr Porcine EST 等数据库进行同源序列比较,发现其中有 11 个未知新序列,可能代表“双肌臀”大白猪肌肉组织特异表达的新基因. 对文库中所包含的兰尼啶受体基因 (RYR1)、钙依赖性蛋白激酶 基因 (CAMK2)、人类胰岛素生长因子结合蛋白 -7 基因 (IGFBP7),以及 695号、 882号和480号3个新基因进行了实时荧光定量 PCR 检测,结果显示： RYR1、 CAMK2 及 IGFBP7 基因在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量,分别为对照的非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.87、 1.90 和 1.85 倍; 695 号、 882 号和 480 号 3 个新的 ESTs 在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量为非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.48、 1.44 和 1.78 倍. 这提示我们,上述基因的上调表达很可能与猪双肌臀性状的发生有密切的关系,可以作为研究该性状的候选基因.     

二花脸和大白猪脂肪leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达的发育性变化

为研究猪脂肪组织中leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达发育性变化的性别差异和品种特点, 分别于出生当天, 3, 20, 30, 45, 90, 120和180日龄随机屠宰二花脸公、母猪, 大白猪公猪各4头, 采集血样、背部皮下脂肪组织和下丘脑. 用放射免疫法测定血清leptin浓度, 用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法, 以18S rRNA作内标, 定量分析脂肪组织中leptin和下丘脑Ob-Rb基因表达的发育性变化, 并进行品种和性别间比较. 结果显示: 脂肪组织中leptin mRNA的表达有明显的发育性变化, 随日龄增加而增高, 母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 二花脸猪和大白猪血清leptin水平的发育性变化模式基本相同, 随日龄增加而增高, 且与脂肪组织中leptin mRNA表达的发育性变化高度正相关(P<0.05或P<0.01), 有性别和品种差异, 总体上母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 而下丘脑中Ob-Rb mRNA的表达呈现明显不同的发育及品种特点, 在出生后逐渐下降, 然后逐渐回升, 断乳后又逐渐下降, 二花脸猪在120~180日龄又逐渐回升. 大白猪Ob-Rb的基因表达在总体上高于二花脸猪(P<0.01). 结果提示: 二花脸猪和大白猪血清leptin水平和脂肪组织中leptin的基因表达与脂肪沉积相关.     

猪肌肉组织差异表达ESTs的克隆与分析

中国地方猪种与引进瘦肉型猪种在肌肉生长和猪肉品质性状上表现出明显的差异. 为了研究中外猪种这种表型差异的原因, 寻找可能与猪生长或肉质性状相关的基因, 本研究应用银染mRNA差异显示技术, 对广东地方品种蓝塘猪和大白猪成年的眼肌组织mRNA进行比较分析, 并运用生物信息学技术对新发现的1条表达序列标签(ESTsp3)进行了深入的分析. 结果表明: (i) 采用30种引物对组合检测到蓝塘猪和大白猪眼肌组织近2000条cDNA片段, 分离得到在两品种中存在差异表达的6个猪肌肉组织ESTs, 对差异片段进行克隆测序, 所有序列被GenBank收录. (ii) 用电子延伸的方法得到了ESTsp3的一段786 bp序列, 经ORF分析预测其中含有一个83 aa的完整开放阅读框架, 并用RT-PCR方法对延伸序列进行了验证. 电子表达谱分析表明ESTsp3在人的不同生长时期及绝大部分组织器官(如软组织、皮肤、骨骼肌和肾等)均有表达, 但存在表达量的差异.     

猪SFRP4基因的表达规律及sp600125对前体脂肪细胞分化的影响

分泌型卷曲相关蛋白（SFRP4, secreted frizzled-related protein 4）是Wnt信号通路可溶解的调控子.本研究通过高通量测序（Solexa）技术、实时定量PCR（RT-qPCR）对瘦肉型和脂肪型猪不同生长阶段脂肪组织中SFRP4表达规律进行研究;用western免疫印迹及RT-PCR技术对脂肪细胞分化过程中SFRP4蛋白表达和mRNA表达进行检测;用JNK信号通路特异性抑制剂sp600125处理猪原代前体脂肪细胞,研究抑制JNK信号通路对猪前体脂肪分化以及SFRP4 mRNA和蛋白表达的影响.结果显示,SFRP4 在脂肪型猪脂肪组织表达量显著高于瘦肉型猪(P<0.01);不同组织检测结果发现,SFRP4广泛表达于各个组织,并高表达于脂肪组织;前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中SFRP4表达量逐渐升高;sp600125促进了前体脂肪细胞分化,引起了 PPARγ、FABP4 、ATGL、Perilipin的显著升高(P<0.01),而SFRP4的表达被显著抑制.本研究为调控脂肪细胞分化关键基因的筛选提供新的理论参考.     

不同品种猪HSL基因5''''-UTR和外显子Ⅰ片段的克隆测序及多态性分析

激素敏感脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)是负责分解脂肪组织中甘油三酯释放游离脂肪酸的关键和限速酶,也是影响动物脂肪沉积的关键酶.将HSL基因作为影响猪脂肪代谢和沉积相关性状的候选基因,对不同品种猪HSL基因5’-UTR和外显子Ⅰ片段进行了克隆测序并开展多态性与性状间的关系研究.序列比较发现,在测定的HSL基因靠近起始密码子(ATG)的419 bp中,杜洛克、梅山猪、大白猪和平序列完全一致,与长白猪序列比较,在-13～-12 bp位置存在GC→CG的碱基变异;梅山猪(3个体)、通城猪(3个体)、长白猪(3个体)、大白猪(3个体)HSL基因外显子Ⅰ的442 bp位置有G→A碱基间的变异,G→A的转换改变了限制性内切酶BsaHⅠ酶识别位点,且导致了编码氨基酸Val→Ile的替换.经PCR-RFLP分析,HSL基因外显子Ⅰ BsaHⅠ位点多态性有AA、AG和GG 3种基因型.”大白×梅山”F2代资源家系BsaHⅠ点不同基因型个体背膘厚、肌内脂肪等性状协方差统计分析发现,AG基因型和GG基因型在眼肌面积上存在显著差异.     

猪小窝蛋白1（caveolin-1）的基因结构及在各组织中的表达分析

caveolin基因家族成员在基础细胞过程如细胞的形态调控、迁移以及肌肉细胞中基因的表达方面发挥着重要作用．本研究采用大白猪与广东蓝塘猪的背最长肌,利用mRNA差异显示技术对caveofin基因家族成员caveolin-1（Cav-1）进行了鉴定．同源分析结果表明,猪Cav-1蛋白的氨基酸序列中有一个caveolin结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性．RT-PCR分析发现,该蛋白在本实验所检测的猪心脏、肝、肾、大脑、脾、肺、背最长肌和背膘等8个部位组织中均有表达,其中背膘表达量最高．采用实时荧光定量PCR,首次证实该蛋白在蓝塘猪与大白猪的背膘及背最长肌中的表达量存在极显著与显著性差异,该结果表明Cav-1基因可能是一个胴体性状的候选基因．同时也说明,利用猪作为研究小窝蛋白在脂肪沉积中信号传导机制的动物模型将为未来研究提供非常有价值的信息．     

猪小窝蛋白1(caveolin-1)的基因结构及在各组织中的表达分析

caveolin基因家族成员在基础细胞过程如细胞的形态调控、迁移以及肌肉细胞中基因的表达方面发挥着重要作用.本研究采用大白猪与广东蓝塘猪的背最长肌,利用mRNA差异显示技术对caveolin基因家族成员caveolin-1(Cav-1)进行了鉴定.同源分析结果表明,猪Cav-1蛋白的氨基酸序列中有一个caveolin结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性.RT-PCR分析发现,该蛋白在本实验所检测的猪心脏、肝、肾、大脑、脾、肺、背最长肌和背膘等8个部位组织中均有表达,其中背膘表达量最高.采用实时荧光定量PCR,首次证实该蛋白在蓝塘猪与大白猪的背膘及背最长肌中的表达量存在极显著与显著性差异,该结果表明Cav-1基因可能是一个胴体性状的候选基因.同时也说明,利用猪作为研究小窝蛋白在脂肪沉积中信号传导机制的动物模型将为未来研究提供非常有价值的信息.     

影响猪肉嫩度的遗传因素

嫩度是猪肉品质的一个重要方面。影响猪肉嫩度的因素很多,遗传因素是改善猪肉嫩度的关键。本对肌纤维性状、钙蛋白酶蛋白水解系统和肌内脂肪的有关基因进行了论述,包括MyoD基因家族、钙调蛋白激酶(CaMK)基因、钙激中性蛋白酶(CAPN)基因、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因、脂肪组织脂肪酸结合蛋白(F一FABP)基因、过氧化氢酶体激活增殖受体（PPARγ)基因以及与肌内脂肪有关的QTL。其中有些已被认为是肉嫩度的候选基因。对改善猪肉嫩度所面临的问题及研究前景进行了讨论。     

猪脂肪酸结合蛋白4启动子的克隆及转录活性分析

该研究旨在解析猪(Sus scrofa)脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因的转录调控机制,并获得猪脂肪组织特异性启动子元件。以6月龄大白猪为材料,通过荧光定量PCR结合Western blot证明了猪FABP4为脂肪组织特异性表达较强的基因,并分析推断其核心启动子区位于-2115 bp—-2066 bp;克隆得到从起始密码子开始到其上游的870 bp、2 914 bp、5 060 bp片段,分别构建了双荧光素酶报告载体并将其命名为pGL3-F-1 Kb/3 Kb/5 Kb,分析发现pGL3-F-3 Kb在脂肪细胞中的活性最高,而在非脂肪细胞中无活性;通过与脂代谢密切相关转录因子(C/EBPα、KLF4和C/EBPβ)共转染发现,C/EBPα正调控FABP4转录活性,而KLF4和C/EBPβ负调控FABP4的转录活性。研究表明,猪FABP4基因的起始密码子上游3 Kb片段具有脂肪组织特异启动子活性,可以用于构建脂肪组织特异性基因修饰猪。     

香猪5个单核苷酸位点的多态性与产仔数的关联分析

为了寻找影响猪产仔数的功能基因,本研究选取5个候选SNP位点CASI0003452、DIAS0001380、ALGA0071919、MARC0052565和ALGA0045832,采用等位基因特异PCR方法对候选位点的多态性变化进行群体研究。结果表明:香猪群体中C~(452)位点以BB基因型为主,低产群的B等位基因频率明显高于高产群(p0.05),两个香猪群体的B等位基因频率明显高于大白猪(p0.05)。D~(380)位点,两个香猪群的A等位基因频率低于于大白猪,且与乳头数呈弱的正相关;香猪和大白猪群体中A~(919)和M~(565)位点在香猪和大白猪群体中的基因型均为CC型,没有多态性;A~(832)位点两个香猪群A等位基因频率明显低于大白猪(p0.05)。经测序证实D~(380)位点处于C1GALT1基因外显子1中,属于同义密码子突变(GCC→GCU),存在密码子偏好性,可能影响香猪C1GALT1基因的表达,可能与香猪的性早熟有关。C~(452)位于PDIA4基因内含子4中,已知PDIA4基因直接影响繁殖的主效基因ER的结构和功能,推测C~(452)位点的多态性有可能影响PDIA4蛋白的表达,进而干扰卵母细胞成熟、受精及胚胎的早期发育等生理过程。     

猪脂肪组织和原代脂肪细胞中GPR43基因的转录表达规律

根据GenBank已发表的人、小鼠及大鼠GPR43(G protein-coupled receptor 43)基因序列, 设计并合成一对引物, RT-PCR扩增获得猪GPR43基因cDNA, 并利用PCR技术检测该基因在不同猪种、不同发育阶段、不同部位脂肪组织及原代脂肪细胞中的转录表达规律。结果显示, 成功克隆猪GPR43 cDNA片段, 长度为486 bp (GenBank登陆号为EU122439); 同源性分析发现, 猪GPR43与人、小鼠和大鼠同源性达83%以上; GPR43 mRNA表达量在脂肪型猪种上显著高于瘦肉型猪种, 随月龄增长表达量逐渐上升, 且皮下脂肪表达量较内脏脂肪高; 在猪前体脂肪细胞诱导分化过程中, GPR43 mRNA表达量呈时间依赖性升高。揭示GPR43 mRNA表达与猪肥胖程度、年龄、脂肪沉积部位以及脂肪细胞分化程度密切相关。