HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药情况调查及外周血CD8+T细胞CD38表达水平研究

摘要 目的：分析人免疫缺陷病毒/艾滋病（HIV/AIDS）患者抗病毒治疗前HIV-1耐药以及影响因素,探讨HIV/AIDS患者外周血CD₈⁺T细胞CD₃₈表达（CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比）与CD₄⁺T淋巴细胞计数的相关性。方法：选择2016年3月至2019年12月我院接诊的442例HIV/AIDS患者（HIV/AIDS组）和163例同期于我院进行体检的健康志愿者（对照组）,HIV/AIDS组扩增pol基因,进行HIV-1基因耐药分析,检测CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比、CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数。分析HIV/AIDS患者HIV-1耐药的影响因素,分析CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数相关性。结果：HIV/AIDS组442例HIV/AIDS患者中376例获得HIV-1 pol基因序列,HIV-1耐药35例,耐药率9.31%（35/376）。单因素分析结果显示耐药组和非耐药组在年龄、文化程度、感染途径、HIV病毒载量方面差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示同性性传播、注射吸毒、高HIV病毒载量是HIV/AIDS患者抗病毒治疗前HIV-1耐药的危险因素（P＜0.05）。HIV/AIDS组外周血CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数低于对照组（P＜0.05）,CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比高于对照组（P＜0.05）。CD₈⁺CD₃₈⁺T淋巴细胞百分比与CD₄⁺T淋巴细胞计数、CD₈⁺T淋巴细胞计数呈负相关（P＜0.05）。结论：抗病毒治疗前HIV/AIDS患者存在一定HIV-1耐药率,传播途径、HIV-1病毒载量与HIV-1耐药有关。CD₈⁺T细胞表面CD₃₈过表达与HIV/AIDS 患者CD₄⁺T T细胞的过度消耗有关。     

烟曲霉几丁质酶基因的克隆与表达

Chi4 4是烟曲霉 (Aspergillusfumigatus)YJ-407产生的一种胞外几丁质酶。通过用真菌几丁质酶保守氨基酸序列与Chi44的N-端序列检索烟曲霉部分基因组序列数据库 ,获得一个编号为contig555的烟曲霉基因组序列 ,可能包含烟曲霉几丁质酶的基因。根据检索结果用RT-PCR方法从烟曲霉YJ-407中克隆到1.4kb的cDNA片段 ,该cDNA的ORF编码一个395个氨基酸的蛋白 ,分子量为43.6kD。对其推导氨基酸序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源 ,而且活性中心与人巨噬细胞几丁质酶高度同源。该cDNA已在E .coli与PichiapastorisGS115中获得表达 ,分别获得 43kD和44kD的重组蛋白 ,两种重组蛋白均有几丁质酶活性。与野生酶相比 ,大肠杆菌表达的43kD重组酶及Pichia酵母表达的44kD重组酶稳定性下降 ,说明Chi44的糖基化修饰可稳定酶蛋白.     

绮丽刺毛霉的一种新型甘氨酸氨肽酶的研究

研究了产自于绮丽刺毛霉（Actinomucor elegans）的一种甘氨酸氨肽酶。分子筛层析表明该酶的天然分子的分子量为320kD,SDSPAGE分析表明蛋白质的亚基分子量为565kD。该酶水解含有甘氨酸残基的底物（如glycinenaphthylamine）的效率要较其它氨基酸残基高得多。该酶的最佳反应温度为30℃,最佳pH为8.0。酶的Km和Kcat值分别为0.24mmol/L与1008 s^-1。1.0mmol/L Zn²⁺,Cu²⁺和Cd²⁺可完全抑制该酶的活性。作用于酶巯基的化学物质对酶活性都有抑制作用。根据络合剂反应的实验结果表明该酶是一种含有金属的酶。当与蛋白酶共同作用时该酶除了甘氨酸外还能提高脯氨酸、精氨酸及谷氨酸的水解率。     

肿瘤中neu基因的过量表达及其抑制

neu基因编码一种和表皮生长因子受体同源的磷酸蛋白,具有酪氨酸激酶的活性.近年来在多种人类肿瘤中发现neu基因的扩增和(或)过量表达.一些蛋白质因子或化学药物可以在转录水平阻遏neu基因的过量表达或者降低其产物p185^neu的酪氨酸激酶活性,抑制具有neu基因过量表达的癌细胞的转移和增殖.     

茶树花多糖免疫调节与抗肿瘤活性的研究

茶树花富含多糖,是茶树生长过程中的产物,然而目前茶树花多糖(tea plant flow polysaccharide, TFP)尚未被充分利用．因此,认为茶树花多糖有着和茶叶中的多糖相似的功能效果．研究目的是通过系列的体内和体外实验系统来评价茶树花多糖的抗肿瘤以及免疫调节的活性．利用S180(sarcoma 180)荷瘤小鼠模型,系统地研究了灌胃不同剂量茶树花多糖对荷瘤小鼠的肉瘤抑制率、存活率以及细胞免疫的影响．结果显示,连续灌胃10天茶树花多糖,能显著抑制S180肉瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,增强迟发型超敏作用(delayed-type hypersensitivity, DTH),促进血液白介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)的分泌,增强巨噬细胞的吞噬作用,改善T淋巴细胞亚群CD4⁺数量以及CD4⁺/CD8⁺的比值,表明茶树花多糖能增强机体对肿瘤的防御,在一定程度上归功于其对免疫调节作用．     

桑黄发酵液中凝集素SHL24的分离与生物活性研究

【背景】桑黄是一种具有很高药用价值及广泛应用前景的药用真菌,其主要有效成分为多糖。凝集素则是桑黄所含的另一类生物活性物质,具有免疫调节、抗肿瘤及抗菌等作用。【目的】从药用真菌桑黄发酵液中分离纯化凝集素SHL24,并对其生物活性进行初步探究。【方法】通过冷冻干燥、Sephadex G-50、DEAE Sephadex A-25、MPLC-MonoQ和LPLC-Sephadex G-75等方法,从药用真菌桑黄的发酵液中进行分离纯化;利用LPLC-Sephadex G-75和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其分子质量;检测不同pH、金属离子、糖、发酵时间、血红细胞、温度对其凝血活性的影响。【结果】从药用真菌桑黄发酵液中分离到单一蛋白条带,SDS-PAGE凝胶电泳检测其分子质量约为24 kD,与分子筛层析法分析的分子质量一致,表明该凝集素为单亚基蛋白。SHL24可以凝集供试的小鼠血红细胞和4种血型人血的血红细胞,但对不同来源的血红细胞凝集程度不同。糖抑制试验表明,SHL24不被D-甘露糖、D-麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、树胶醛糖、D-乳糖以及L-鼠李糖所抑制。热稳定性试验和金属离子对SHL24凝血活性影响试验表明SHL24具有较好的热稳定性且其凝血活性不受Ca~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)等二价阳离子的影响。【结论】SHL24具有的稳定理化性质和生物活性,有作为蛋白质药物的潜质。     

烟草NtNHX1 3基因的克隆及表达特性

以栽培烟草‘云烟87’为材料,通过同源克隆方法分离了烟草NHX（Na⁺,K⁺/H⁺ exchanger）基因NtNHX1 3。结果表明：NtNHX1 3基因CDS长度1 617 bp,编码蛋白质长度为538 aa,蛋白理论等电点为8.67,分子量为59.34 kD。预测NtNHX1 3属于膜蛋白,含有11个跨膜区,且含有NHX类蛋白保守位点氨氯吡嗪咪结合位点。进化树分析显示,NtNHX1 3与菊苣、野菊花NHX遗传距离最近。qRT PCR组织特异性表达分析表明,NtNHX1 3在烟草叶片中表达量最高,根、茎、花中也有表达;盐胁迫处理后NtNHX1 3基因的表达上调,表明该基因参与了盐胁迫反应;打顶初期NtNHX1 3基因的表达呈逐渐上调的趋势,与该时期钾含量逐渐升高相吻合。研究推测,NtNHX1 3具有将钾离子从细胞质转运至液泡的功能。     

姜黄素调节小鼠免疫功能的实验研究

目的探讨姜黄素对小鼠免疫功能的调节作用及其可能机制.方法通过噻唑蓝(MTT)比色法研究姜黄素对小鼠脾淋巴细胞增殖及小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能的影响;用Western blot法检测脾淋巴细胞胞核NF-κB p65蛋白的表达.结果姜黄素能够增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能;小剂量姜黄素能够增加小鼠脾淋巴细胞的增殖;大剂量姜黄素能够抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖;姜黄素能够抑制脾淋巴细胞胞核NF-κB p65蛋白的表达.结论姜黄素具有调节机体免疫功能的作用,且与剂量相关;可能的机制与抑制NF-κB的活性有关.     

人肾液泡型H＋－ATPase 58kD亚基基因的表达

在大肠杆菌中表达了人肾液泡型H^＋-ATPase 58kD亚基的基因,利用聚合酶链式反应(PCR)得到了58kD亚基的编码片段.直接将PCR产物连接到PET载体上表达.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明58kD亚基的基因得到高效表达.表达产物可达细菌细胞质蛋白的50%.     

重组人sBLyS表达纯化条件的优化、理化特征及生物功能研究

构建了原核表达质粒p ET-30a(+)/sBLyS,转化大肠杆菌BL21(λDE3),IPTG诱导表达的重组蛋白以可溶部分和包涵体两种形式存在,为了提高可溶部分重组蛋白的比例,确定16℃为诱导表达的温度,最佳表达时间为12h。在此条件下大规模诱导表达,经Ni²⁺亲和层析获得重组人sBLyS。重组蛋白的等电点约为7.1～7.3,活性状态时是非共价连接的同源三聚体。MTT法测重组人sBLyS对B淋巴细胞的增殖作用结果表明,B细胞经抗IgM原血清活化后,它的增殖程度在一定的重组人sBLyS浓度范围内随其浓度的增加而提高,sBLyS刺激时间对B细胞增长也有显著影响,sBLyS以2μg/mL刺激3d B淋巴细胞的增殖达最大。     

小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液及其超滤组分对粒巨噬系祖细胞生长的影响

本研究通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞系细胞,收集无血清条件培养液(mBMECCM),将其作多级串联超滤,获得分子量大于10、3～10、1～3、05～1kD和小于05kD超滤组分。进行粒巨噬系造血祖细胞集落形成试验,检测了它们的作用。mBMECCM和3～10kD组分对粒巨噬系祖细胞(CFUGM)生长未见明显影响,而分子量大于10kD和05～1kD组分促进CFUGM的增殖,分子量1～3kD和小于05kD组分则抑制CFUGM的增殖。这4种超滤组分对CFUGM生长的效应均有剂量依赖性。这些结果提示,在体外培养条件下,小鼠骨髓内皮细胞分泌若干种活性成分,分别对CFUGM的生长起促进或抑制作用     

分子伴侣 SecB 基因和人淋巴毒素基因在大肠杆菌中的共表达

分于伴侣(Chaperohe)是细胞内催化及维持其他蛋白质正确梅象的一类蛋白质分子^[1,2]。研究表明,分子伴侣参与细胞内许多蛋白质的折叠、聚合以及跨膜运输^[3,4],通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中间体,阻止了蛋白中间体的聚集,帮助其形成正确构象^[5,6]。SecB是一个胞质酸性蛋白．单体分子量为17kDa,在体内以4～6个相同亚基组成的寡聚体形式存在。它在大肠杆菌中参与蛋白质分泌系统,纯化后进行离体试验表明,它可以阻止抗蛋白酶的pre-MBP的出现,能稳定地结合前体蛋白．使其处于适合运输的构型^[7],它的作用是使蛋白质可以在正确折叠前跨过细胞膜,运输到细胞周质中。SecB通过与前体蛋白结合．从而阻止前体蛋自由于不正确折叠发生的聚集,属于分子伴侣家族的成员。分子伴侣的这些特性使得它们在基因工程中具有广阔的应用前景。外源蛋白在大肠杆菌中高表达时往往形成无活性的包涵体,包涵体大多是蛋白质在过量表达过程中不正确折叠形成的^[8],正确构象的形成需要在体外进行变性和复性。蛋白质的复性过程十分复杂,在方法上缺少一定的规律可循,特别是分子量较大以及二硫键较多的分子,复性更加困难,有的甚至根本难以复性。分子伴侣可以促进其它蛋白质的正确折叠,设想在基因工程中如果将分子伴侣基因与外源蛋白基因共存表达,可能会有效地促进外源蛋白形成正确的构象．提高其活性,减少包涵体的形成,对基因工程下游的处理带来很大方便。根 据这个思路,我们将克隆的SecB基因与重组人淋巴毒索(Lymphotoxin,简称LT)基因在同一个大肠杆菌细胞中共存表达,来研究分子伴侣SecB对外源基因表达的影响。     

急性热暴露大白鼠肝脏热休克蛋白形成的研究

本研究采用人工气候室模拟自然热环境对大白鼠进行急性热暴露实验。用苯酚法提取大白鼠肝脏总RNA;用 Oligo(dT)-纤维素亲和层析柱分离出Poly(A)⁺mRNA。将各条件下的大白鼠肝脏Poly(A)⁺mRNA在麦胚无细胞体外转译系统中表达。结果证明急性热暴露大白鼠肝脏同样能生成分子量分别为71kD、90kD、98kD和 110kD的一组热休克蛋白。     

猪胎盘脂多糖的分离纯化及其对脾淋巴细胞的诱导作用

 健康猪胎盘经酶解,提取,氯仿-正丁醇除杂蛋白与5'-磷酸二酯酶除核酸,再经透析,乙醇沉淀,DEAE-Dextran-Gel A-25层析制得纯品猪胎盘脂多糖(简称P-脂多糖)。分析结果表明,P-脂多糖是一种类酸性粘多糖与脂质的共价结合物,分子量约为75kD,分子中含11种单糖组成,其中半乳糖含量最高,其次为岩藻糖,氨基已糖和已糖醛酸。体外实验发现P-脂多糖能明显诱导小鼠淋巴细胞的增殖,强烈地促进淋巴细胞的DNA合成,刺激指数约为9.3,最适刺激浓度50～60μg/mL,最适刺激时间48小时,同时能明显促进淋巴细胞的蛋白质合成。实验还证实,P-脂多糖对脾淋巴细胞的增殖诱导作用并不是通过依赖于白间素-2(IL-2)途径,而是通过增强淋巴细胞IgM的表达,表明P-脂多糖是一种促B-淋巴细胞分裂剂。     

小鼠干扰素-γ诱生单核因子在昆虫细胞中的高效表达及其血管生成抑制作用

干扰素 - γ诱生单核因子 (monokine induced by interferon- γ, MIG , CXCL9) 是一种具有趋化 T 淋巴细胞 NK 细胞的 CXC 趋化因子家族成员之一 . 通过 RT-PCR 技术从小鼠脑组织中克隆了小鼠 MIG cDNA ,利用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统构建了 MIG 重组杆状病毒,并在 Tn-5B1-4 昆虫细胞内将其进行了表达,最后对表达产物进行了纯化和活性鉴定 . 结果显示：小鼠 MIG 蛋白在 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中可得到高效分泌性表达;分泌到培养上清中的重组 MIG 蛋白经 S-Sepharose 纯化后得到的 MIG 蛋白纯度约为 90% ,产量为 10 mg/L;在 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析中该蛋白质分子质量显示为 14.4 ku 左右;该纯化蛋白在体外具有诱导 CTLL-2 淋巴细胞钙离子内流和抑制血管内皮细胞迁移和增值的活性,在鸡胚尿囊膜实验中小鼠重组 MIG 具有抑制新血管生成的功能 . 实验表明,在杆状病毒系统中高效表达的小鼠重组 MIG 蛋白具有抑制内皮细胞迁移、增殖和血管生成活性,为今后进一步研究其血管生成抑制活性的机理和将其应用于肿瘤血管抑制实验建立了基础 .     

一种新的植物低分子量ATPase的纯化及性质研究

采用丙酮粉技术,DEAE-Sephadex A50及FPLC离子交换层析技术从玉米花粉胞质中分离纯化了一种具有ATPase活性和GTPase活性的低分子量可溶性蛋白,纯化倍数为105倍.用SDS-PAGE、二维电泳及薄层扫描技术分析了分离样品的纯度.亚基分子量约为38ku,非变性PAGE测定的全酶分子量为76ku,表明该酶分子是由两个相同亚基组成的二聚体蛋白.等电聚焦电泳测定其等电点为5.6,是酸性蛋白质.用抗牛脑dynamin或kinesin的抗体进行Western-blotting,结果表明该酶蛋白与它们无免疫交叉反应.药理学研究表明:38ku蛋白对Na₃VO₄及NEM均非常敏感.     

尿激酶前体的纯化及其性质的研究

尿激酶前体是与尿激酶具有共同抗原性的一种新的纤溶酶原激活物。我们从人胎肾细胞条件培养液中提纯该物质。首先用抗UKIgG-Sepharose亲和层析得到尿激酶抗原相关蛋白,然后利用苯甲脒-Sepharose柱去除尿激酶获纯化的尿激酶前体。纯化倍数达930倍,得率为18％,所得尿激酶前体为单肽链结构蛋白质,分子量55kD,比活(11389IU/mg)低于尿激酶,二异丙基氟磷酸酯(DFP)不能抑制其活性。体外¹²⁵I-血凝块溶解试验表明尿激酶前体可特异地诱导血凝块溶解,对血浆纤溶系统无明显激活作用,血凝块溶解的时间曲线呈特征性“S”型。所得尿激酶前体是一种新的有别于尿激酶的纤溶酶原激活物。     

施氏鲟卵黄蛋白原及其相关蛋白的研究

采用凝胶柱层析、聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹（Western blotting）和免疫扩散等方法对施氏鲟卵黄蛋白原（Vi-tellogenin,Vg）及其相关蛋白（Yolk protein,YP）进行了研究。结果表明,施氏鲟血清Vg是一种糖脂磷蛋白,其相对分子量为410kD,由分子量为205kD的两个同源亚基组成。Vg的3种相关蛋白YP1、YP2和YP3。其中YP1相对分子量为370kD,是一种糖脂磷蛋白,由相对分子量为97kD和33kD的两个亚基构成。YP2是一种相对分子量为144kD的磷脂蛋白,由相对分子量为94kD和45kD的2个亚基构成。YP3为相对分子量为66kD的磷蛋白,由相对分子量为30kD的同源亚基构成。     

黄粉甲幼虫抗菌物质的诱导及其抗菌活性

采用饥饿法、紫外线照射法和针刺法处理黄粉甲Tenebriomolitor 6龄幼虫后均能诱导其 产生抗菌物质,收集的血淋巴上清液对真菌有抑制作用,对细菌无抑制作用;经热处理后的血 淋巴上清液则对细菌有抑制作用,而对真菌无抑制作用。SDS-PAGE检测结果发现,与未诱导的 对照相比经诱导的黄粉甲幼虫血淋巴中,原有的一类大分子蛋白质如分子量分别为97kD、44 kD和37 kD左右的蛋白质缺失;而ESI-MS分析结果显示诱导后比诱导前黄粉甲幼虫血淋巴中有 小分子物质产生,推测可能是此类缺失蛋白质分解为小分子量的抗菌肽,从而表现出抗菌活性 。     

酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．