拟南芥VHA-c3启动子的GUS基因融合表达

VHA-c3基因是拟南芥液泡H+-ATPase c亚基的5个同源基因之一,已有研究结果表明其与植物抗非生物胁迫有关。本论文在克隆不同长度VHA-c3基因上游调控序列的基础上,利用GUS报告基因,研究了VHA-c3基因的植物组织及器官定位。结果表明：VHA-c3起始密码子上游772bp的序列内存在着VHA-c3基因的基本启动子元件,可指导基因组成型表达在拟南芥的叶片、表皮毛、叶柄、根、雄蕊、柱头和萼片;在VHA-c3起始密码子ATG上游2812bp-2234bp片段和1496bp-772bp片段中各存在一个负调控元件,在2234bp-1496bp片段中存在一个正调控元件,它们的存在可控制基因在气孔中的表达。     

BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞周期进程所必需的

B型细胞周期蛋白(Cyclin B)是细胞G2期向M期转化的重要调节因子. 家蚕基因组数据分析表明, 家蚕有2个Cyclin B基因, 即BmCyclin B和BmCyclin B3. 利用家蚕EST数据, 成功克隆了家蚕Cyclin B3基因(EU074796), 该基因全长1665 bp, ORF长1536 bp, 由6个内含子和7个外显子构成, 编码511个氨基酸, 含有1个蛋白破坏盒和2个周期蛋白盒, 预测分子量57.8 kD. 家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1的BmCyclin B和BmCyclin B3基因RNA干涉结果表明, BmCyclin B和BmCyclin B3是家蚕细胞完成细胞周期进程所必需的, 二者干涉后均能导致细胞周期阻滞于G2/M期, 抑制细胞的增殖.     

番茄SlWRKY31基因启动子的克隆与逆境应答模式分析

该研究以野生型番茄（Solanum lycopersicum）为材料,采用PCR技术克隆得到了番茄 SlWRKY31 基因起始密码子 ATG 上游启动子序列,并利用该启动子驱动 GUS基因在野生型番茄中表达,对获得的转基因番茄采用不同胁迫处理后进行GUS 染色和定量分析。结果表明：（1）序列分析显示,该启动子全长1 849 bp,含有多个与非生物胁迫和激素响应相关的顺式作用元件,主要包括热胁迫响应元件 HSE、干旱诱导响应元件 MBS、防卫和胁迫响应元件 TC rich repeats、创伤诱导响应元件 WUN motif、脱落酸（ABA）响应元件 ABRE 和水杨酸（SA）响应元件 TCA element。（2）实时荧光定量 PCR 结果显示,SlWRKY31 基因呈组成型表达模式,且在叶和果实中表达量较高,茎中较低;在NaCl、甘露醇、SA、ABA 和42 ℃ 高温的胁迫处理下,其表达量显著升高。（3）构建 SlWRKY31 启动子和 GUS 基因融合的植物表达载体,并通过农杆菌介导法将其转化野生型番茄,对获得的转基因番茄进行 GUS 组织化学染色分析结果显示,SlWRKY31 基因在番茄的各个组织（根、茎、叶、花、果实和种子）中均有表达,表明 SlWRKY31 启动子是组成型表达启动子。（4）对转基因番茄在不同胁迫处理后的 GUS 染色和定量分析显示,SlWRKY31 启动子显著受到NaCl、甘露醇、SA、ABA 和42 ℃ 高温的诱导表达,说明该启动子是一个可以响应多种逆境胁迫的诱导型启动子。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

家蝇抗菌肽基因的表达模式研究

本研究曾报道过家蝇生长过程中的3个基因attacin, defensin, cecropin的转录体. 通过运用实时定量PCR定量分析家蝇不同发育阶段和诱导后不同时间点的三龄幼虫mRNA水平, 结果显示3个基因在三龄幼虫和成虫期转录水平较高. 同时分析发现, 在诱导后mRNA水平显著增加, 3个抗菌肽基因在敏感菌诱导后转录水平相对诱导前分别有cecropin 805倍、attacin 1009倍、defensin 2500倍的增强. 结果提示, 家蝇抗菌肽基因的转录在不同发育阶段和诱导后的不同时期是有差异的.     

人工合成启动子SAR在拟南芥中的表达分析

利用植物防御基因中的病原诱导响应元件和最小35S启动子(-62～+1),人工合成了启动子SAP,并以GUS基因为报告基因,在转基因拟南芥中分析了合成启动子的表达特性.通过对转基因拟南芥GUS组织染色的分析表明:SAR启动子在子叶、毛刺、根茎交接处和根系中优势表达,在老叶中的表达量高于幼叶,说明SAR启动子具有组织和发育表达特异性.     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

拟南芥atslA基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出atslA基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,atslA基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

拟南芥亚硫酸盐氧化酶基因AtSO启动子的分离与功能分析

亚硫酸盐氧化酶(SO)作为目前发现的钼酶家族成员之一,在哺乳动物硫化物的脱毒、嘌呤代谢等过程中起着非常重要的作用。然而,很少有关于高等植物SO的表达和调控机制的研究报道。本研究中,我们用半定量RT-PCR和组织化学方法对拟南芥中SO基因AtSO的表达调控进行了初步研究。结果表明,AtSO在拟南芥的地上部分如茎、叶、花和未成熟荚果中有较高的表达水平,而在根部表达水平较低。在对分离的该基因上游1562-bp的启动子区域进行生物信息学分析时,鉴定出一些可能的调控元件如光调控元件(LRE)。转基因植株中AtSO启动子驱动下的GUS基因(uidA)表达结果表明:AtSO的表达主要在植物的地上组织,表达具有光依赖性,且表达水平受亚硫酸盐的诱导增高。这一结果对进一步研究SO在植物对光周期和亚硫酸盐胁迫应答反应中的作用提供线索。     

膜系留转录因子ANAC089在拟南芥开花诱导过程中起负调控作用

NAC(NAM, ATAF1/2和CUC2)转录因子家族为植物所特有, 该家族成员在植物生长发育及对环境胁迫的应答中有重要的调控作用. 近年来, NAC家族中一类被命名为NTLs(NTM1-Like)的膜系留转录因子受到了研究人员的重视. 拟南芥中ANAC089编码具有340个氨基酸的NAC蛋白, 在它的C-末端有一个预测的跨膜结构域. 亚细胞定位表明, 全长的ANAC089蛋白定位在内质网, 而截去跨膜结构域的截短蛋白ANAC089ΔC定位在细胞核内. 长日照条件下, 35S: : ANAC089ΔC转基因植株株型矮小、叶片小而浓绿, 最为明显的是开花延迟. 与此表型相应, 转基因植株中CO, SOC1, FT和LFY的表达水平受到了不同程度地抑制, 而FLC的表达水平被增强. 本研究表明, ANAC089是一个膜系留转录因子, 以截短蛋白ANAC089ΔC的形式进入细胞核内执行转录因子的功能, ANAC089在拟南芥的开花诱导过程中起负调控作用.     

胡杨PeNAC121基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究NAC转录因子家族成员在胡杨（Populus euphratica）逆境胁迫中的响应和调控机制,利用PCR技术从胡杨中克隆了PeNAC121基因的启动子序列,并采用生物信息学工具对该启动子的结构特征进行了分析,最后利用该启动子驱动GUS报告基因在三倍体毛白杨（Populus tomentosa）中表达,并对获得的转基因植株采用不同胁迫处理后进行了GUS染色和酶活性定量分析。结果表明,克隆获得的PeNAC121基因的启动子长度为1 997 bp（起始密码子ATG上游）,启动序列中除了含有大量的光响应元件,还含有多个与非生物逆境胁迫和激素响应相关的元件,如低温响应元件LTR、干旱响应元件MBS、防卫和胁迫响应元件TC-rich repeats、脱落酸（ABA）响应元件、以及赤霉素（GA）响应元件等。基因的组织表达模式检测结果显示,PeNAC121基因主要在茎中表达,在根和叶中的表达较少。GUS组织化学染色和酶活性检测结果表明,胡杨PeNAC121启动子显著受到NaCl、甘露醇、ABA和4 ℃低温的诱导表达。由上述结果推测PeNAC121基因与胡杨的逆境胁迫应答密切相关,表明该基因的启动子是一个能够应答多种逆境胁迫的诱导型启动子。本研究为阐明PeNAC121基因在胡杨逆境响应和调控中的作用机制提供理论参考。     

拟南芥AtMPK6的信号转导功能和参与发育调控的研究进展

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径主要MAPKKK、MAPKK和MAPK三个组分构成,彼此逐级磷酸化进而传递细胞信号。这些激酶可以将信息从感应器传递到效应器,并在胞内外信号传递中起多种作用。同时,MAPK级联途径通过相互“交谈”形成复杂的信号传递网络,从而有效地传递各种特异信号。迄今为止,拟南芥AtMPK3、AtMPK4和AtMPK6是研究最多的MAPKs。本文综述AtMPK6参与调控植物对逆境胁迫的响应,以及在生长发育过程中的作用,并介绍AtMPK6与蛋白磷酸酶之间的关系。     

高钙逆境对拟南芥根部基因表达的影响

土壤钙含量过高会对植物正常生长发育形成严重的威胁.这是中国西南喀斯特区域农业生产和环境保护的重要限制因素.了解植物对高钙胁迫的响应机制,可以促进喀斯特地区可持续农业发展和生态环境保护.为揭示植物对高钙胁迫相应的分子机理,本研究充分利用拟南芥(Arabidpsis thaliana)丰富的生物信息资源,系统比较和分析了对照和高钙胁迫处理情况下拟南芥根部的基因表达情况.40 mmol/L CaCl2处理明显抑制了拟南芥根部生长.转录组分析表明,高钙处理下,拟南芥根部乙烯、脱落酸和茉莉酸途径表达上调,其中,茉莉酸合成、响应和代谢途径相关基因表达均上调,说明这3个激素相关途径,对植物应对高钙胁迫具有重要的作用,尤其是茉莉酸相关途径.     

拟南芥钙调素结合蛋白基因启动子的克隆及表达

采用PCR技术从拟南芥中克隆了SCBP60g基因的启动子,并与GUS报告基因融合构建重组表达载体,转化野生型拟南芥,对获得的转基因株系进行GUS组织染色,从基因调控水平上探讨其在功能方面的差异。结果显示:SCBP60g基因的启动子能指导GUS报告基因在拟南芥的根、茎、叶和花中表达,并且在这些部位的维管束表达较强。这种表达方式与LCBP60g基因的启动子指导的GUS基因组织化学染色有差异,表明这个启动子的表达调控具有一定的特异性。     

病程相关基因启动子片段与GUS的融合基因在拟南芥中的表达

PR1是拟南芥 (Arabidopsis thaliana L.) 系统获得抗性的一个标志基因。利用PCR技术,从拟南芥中扩增并克隆了PR1基因的启动子片段。将该启动子片段与GUS报告基因拼接,构建成含有PR1-GUS融合基因的重组表达质粒。经根癌农杆菌介导转化,得到了转基因的拟南芥植株。用已知的系统获得抗性激活剂处理转基因植物,检测到GUS活性。因此,这一转基因体系可以作为一种简便、灵敏的实验体系以筛选激活植物系统获得抗性的化合物。     

病程相关基因启动子片段与GUS的融合基因在拟南芥中的表达

PR1是拟南芥(Arabidopsisis thaliana L.)系统获得抗性的一个标志基因.利用PCR技术,从拟南芥中扩增并克隆了PR1基因的启动子片段.将该启动子片段与GUS报告基因拼接,构建成含有PR1-GUS融合基因的重组表达质粒.经根癌农杆菌介导转化,得到了转基因的拟南芥植株.用已知的系统获得抗性激活剂处理转基因植物,检测到GUS活性.因此,这一转基因体系可以作为一种简便、灵敏的实验体系以筛选激活植物系统获得抗性的化合物.     

AtSTP3启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究

利用PCR技术从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中分离了AtSTP3绿色组织特异表达的启动子,序列分析表明,扩增片段(1774bp)与已报道序列的相应区域同源性达99.9%。将其与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种‘中花11’中。对转基因水稻植株中的GUS活性进行定性与定量测定结果表明,AtSTP3启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中特异性表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,AtSTP3启动子表现出明显的组织特异性。