水稻叶绿体蛋白质在生长发育过程中的表达研究

在植物中,叶绿体是负责光合作用的细胞器,对叶绿体内的各种生物过程人们已经积累了很多知识,但对叶绿体蛋白质的表达还所知甚少．为了解水稻叶绿体蛋白质在正常生长发育过程中的表达情况,尝试基于抗体的水稻蛋白质组学策略．选取了10个水稻叶绿体基因,利用表达的蛋白质或合成的抗原决定簇片段制备了抗体,用Western blotting检测了相应蛋白质在5个发育时期的根、茎、叶及穗组织中的表达．发现10个蛋白质均在叶片中表达,在根中不表达．与原初反应相关的叶绿素A/B结合蛋白1和2(CAB1和CAB2)、与电子传递相关的放氧增强蛋白1(OEE1)及与活性氧清除相关的过氧还蛋白过氧化物酶(2-CysP)和硫氧还蛋白(Trx)在茎中表达．而在卡尔文循环中发挥作用的Rubisco活化酶(RCA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、果糖二磷酸醛缩酶(FBPA)和景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶(SBPase)蛋白质在茎中不表达．在穗中,这些蛋白质的表达时序不同,CAB2和2-CysP在穗发育的全程表达,CAB1和OEE1在中后期表达,而卡尔文循环中的蛋白质只在中期表达．有意思的是,卡尔文循环中的蛋白质表达模式相似,这一结果从蛋白质表达水平支持它们之间的相互衔接关系．此外,实验还揭示了可能的蛋白质修饰、二聚体及不同的转录本现象．将目标基因的表达谱与转录谱进行比较,发现二者间有一定的平行性,但也有明显的区别．以水稻叶绿体蛋白质为对象,直观并相对定量地揭示了它们的表达模式,为阐释其功能提供了信息,也为基于抗体的水稻蛋白质组学策略提供了一个初步数据．     

水稻U-Box蛋白质在不同发育时期的表达分析

真核生物基因组中广泛存在U-Box基因,其编码蛋白大部分是泛素系统中决定底物特异性识别的E3蛋白,其构象与RING-finger极其相似．U-Box蛋白质能促进底物蛋白泛素化降解,对细胞内异常蛋白的降解及质量控制方面发挥着重要的作用．水稻基因组中有77个U-Box蛋白质,系统了解它们的表达可为功能研究提供数据．制备针对水稻U-Box蛋白质的抗体,了解水稻中U-Box蛋白质在不同发育时期的表达信息,为功能研究积累数据．选取了4个水稻U-Box蛋白质,其共同结构特点为U-Box结构在N端,C端有ARM结构．用计算机软件预测抗原决定簇,细菌体系体外表达、纯化U-Box蛋白质的片段,免疫动物制备多克隆抗体,用Western blotting检测U-Box蛋白质在水稻品种93-11苗期地上部和地下部、分蘖期根和茎、孕穗期剑叶和幼穗、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和种子中的表达,并与EST数据库中公布的U-Box蛋白质EST数据进行了比较分析．体外克隆表达后,获得了纯化的蛋白质,制备的抗体特异性强,蛋白质印迹(Western blotting)检测可见一条明显的主带,其中Os06g01304和Os12g38210两个蛋白质的表观分子质量与预测分子质量相符,Os01g66130和Os08g01900两个蛋白质的表观分子质量低于预测分子质量．4个U-Box蛋白质在水稻生长发育的不同时期或部位基本上是组成型表达,且表达量接近．对NCBI上公布的来自274个文库100万条以上的EST进行分析,可以看出4个U-Box蛋白质EST的数量分布大致均匀,与Western blotting结果揭示的组成型表达平行,与ATPase、HSP81-3、EGF-1 alpha和RuBisCo等对照基因相比,U-Box基因的EST数目相对很少,说明它们属于低丰度转录的基因．选取了4个水稻U-Box蛋白质,通过抗原决定簇预测,表达片段蛋白,制备了特异性抗体,证明了这一技术路线的可行性．利用抗体对水稻不同发育时期材料进行蛋白质表达谱研究,发现这些U-Box蛋白质呈组成型表达,与EST数据揭示的结果具有平行性．所制备的抗体也为相关功能研究,如免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反应中U-Box蛋白质的表达等,积累了 资源．     

水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导.为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%.重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20 000效价的多克隆抗体.Wescem blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白.     

水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在叶片生长和白叶枯病抗性反应中的表达

钙信号介导植物对多种外部刺激的反应并参与调控广泛的生理学过程。钙离子结合蛋白质, 如类钙调磷酸酶亚基B蛋白质(calcineurin B-like protein, CBL), 对感受和传递钙信号具有重要作用。根据基因组测序及注释分析, 水稻(Oryza sativa)基因组中有10个CBL家族成员。采用基于抗体的蛋白质组学策略, 利用免疫印迹方法研究了水稻CBL蛋白质在叶片生长不同时期的表达, 揭示了其在正常发育过程中的表达模式。然后对Xa21介导的水稻白叶枯病抗性反应不同时间点的蛋白质表达进行检测, 发现OsCBL-1、OsCBL-3、OsCBL-5、OsCBL-9和OsCBL-10这5个蛋白质的表达发生了变化; 进一步比较它们在抗病、感病和对照处理中的表达情况, 发现其在不同反应间的表达也有区别, 提示了CBL蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作过程中的功能。该研究为深入了解水稻CBL蛋白质的功能提供了有价值的线索。     

水稻YTB中OSVDAC5蛋白的原核表达与抗体制备

目的:克隆水稻YTB osvdac5基因,原核表达后获得纯化的OSVDAC5蛋白,制备相应的抗体.方法:采用Trizol法提取水稻总mRNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增得到该基因与原核表达载体连接,构建重组质粒pET-30a-osvdac5,并转入大肠杆菌进行原核表达,SDS-PAGE检测表达产物.通过镍柱纯化获得的单一目的蛋白用于抗体制备,用Western Blot检测抗体的特异性.结果:克隆到原核表达载体中osvdac5基因的ORF为813 bp,编码271个氨基酸.在大肠杆菌中15℃、0.7mmol/L的IPTG浓度诱导17 h是pET-30a-osvdac5融合蛋白表达的优选条件,表达的OSVDAC5蛋白属于包涵体蛋白.镍柱纯化后的OSVDAC5为30 kD左右的单一条带.Western Blot分析表明,抗体能够与30 kD处的OSVDAC5蛋白进行特异性结合.结论:成功克隆了水稻YTB osvdac5基因,原核表达蛋白OSVDAC5制备的多免隆抗体具有一定特异性,能与免疫抗原结合,这为进一步研究OSVDAC5蛋白在植物不同生长发育时期中的表达模式奠定了基础.     

水稻NADP-苹果酸酶的原核表达、纯化和抗体制备

构建了水稻NADP-ME_2基因cDNA的原核表达载体pQE30,并诱导表达出有生物学功能的融合蛋白。用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化出NADP-ME_2融合蛋白,并测定了融合蛋白酶学特性(V_(max)、K_m、K_(cat)、底物特异性)。用纯化的NADP- ME_2融合蛋白免疫家兔,制备出抗水稻NADP-ME特异性抗体。全蛋白双向电泳后Western印迹表明水稻中至少有4个NADP-ME家族蛋白质成员。     

水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1 kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d=PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120 r/min,0.5 mmol/L IPTG诱导60min.经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体.Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础.     

叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片生长过程中的表达研究

叶绿体是绿色植物把光能转化为化学能的重要细胞器.目前,多种植物的叶绿体基因组序列已经获得,对叶绿体内发生的各种生物学过程人们也已经有相当深入的了解,但对叶绿体基因编码蛋白质的表达还所知甚少.用蛋白质印迹实验系统地检测了15个叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片不同生长时期的表达.其中7个与光合作用相关蛋白质的表达具有相似的模式,其表达量随叶片生长而增加,一般在孕穗期、开花期达到最高峰,在成熟期叶片下降,这种模式与水稻生长对光合作用的需求有明显相关性.4个与DNA复制相关的RNA聚合酶在苗期叶片中表达量达到最高,说明这些聚合酶在较早时期发挥作用.4个NADH脱氢酶蛋白质的表达呈2种不同的模式,其中亚基2和4在种子萌发后的早期叶片中就达到最高峰,亚基5和7的最高峰出现在中后期,反映了它们之间功能上的不同.实验结果直观且相对定量地揭示了叶绿体编码蛋白质的表达与叶片生长之间的关联关系,为深入了解其功能提供了重要的线索.     

水稻Argonaute 2蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备水稻Argonaute 2(AGO2)的多克隆抗体,该研究采用RT-PCR扩增OsAGO2蛋白165~401aa片段和440~570aa片段的编码序列,并构建了2个原核表达载体。诱导表达重组蛋白后注射家兔,制备了相应的多克隆抗体,最后利用Western blot初步分析水稻AGO2蛋白的表达模式。结果表明:成功构建2个表达载体,通过诱导获得了分子量约为30kD和23kD的重组蛋白。其中,以440~570aa片段为抗原所制备的多克隆抗体免疫印记效果较好。Western blot表明在水稻花药、愈伤组织及小穗中检测到OsAGO2表达。该研究为进一步深入探讨水稻OsAGO2基因的特性与功能奠定了基础。     

五个水稻类受体激酶的抗体制备及检测

类受体激酶在植物发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病等生命过程中起着重要的调控作用。为了对水稻类受体激酶的功能及生物学特性进行深入研究,本实验克隆表达了水稻中5个类受体激酶抗原表位片段,以纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰兔,获得了特异性较高的多克隆抗体。Western blotting检测结果表明,5个类受体激酶均在叶片中表达。     

水稻叶片对镉胁迫响应的蛋白质差异表达

为揭示水稻镉抗性的分子机理,以抗镉水稻品种P1312777和镉敏感水稻品种IR24为材料,在镉离子浓度为0(对照)、50和100 μmol·L-1条件下水培处理7 d,应用蛋白质组学方法分析了2种水稻叶片对镉胁迫响应的蛋白质差异表达.结果表明:镉胁迫下水稻PI312777叶片中共检测到差异表达蛋白质点31个,通过MALDI-TOF/MS分析,鉴定了其中的24个蛋白质(包括20个不同蛋白质,4个重复检出蛋白质);IR24叶片中共检测到差异表达蛋白质点19个,其中15个蛋白质得到鉴定.PI312777叶片鉴定出的20个蛋白质覆盖了IR24叶片鉴定的15个蛋白质,前者有4个与光合作用相关,11个与细胞防御代谢相关,3个与其他代谢相关,2个为功能未知蛋白.与对照相比,不同浓度镉胁迫下,抗镉水稻PI312777叶片中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型、果糖1,6-二磷酸醛缩酶、硫氧还蛋白和DNA重组修复蛋白均上调表达;镉敏感水稻IR24叶片中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型的表达无显著差异,果糖1,6-二磷酸醛缩酶和硫氧还蛋白则下调表达.此外,DNA重组修复蛋白仅在镉胁迫的PI312777叶片中表达.水稻PI312777比IR24具有更强的镉抗性与这些差异表达的蛋白质密切相关.     

高通量蛋白质组学研究中一种基于 GO 的蛋白质功能分析策略

挖掘高通量实验数据蕴含的生物学意义是蛋白质组学研究面临的一大挑战 . 基于等级化结构化的词汇表 GO (Gene Ontology) 和相关数据库中的蛋白质功能注释,发展了一种对蛋白质组学研究中得到的表达谱 (Expression profile) 进行功能分析的策略 . 在对蛋白质表达谱进行功能注释的基础上给出蛋白质表达谱中蛋白质功能的分布,同时给出感兴趣功能类别的统计信息 . 这有助于对表达谱蛋白质功能的整体理解和深入的生物信息学分析 . 该策略已经成功应用胎肝蛋白表达谱研究中,用户可以通过访问网址 http://www.hupo.org.cn/GOfact/ 使用或者下载我们的程序 .     

水稻Os着-c op 1基因的原核表达及多克隆抗体制备

着-COP蛋白是真核生物分泌途径中COP玉有被小泡的一个亚基。本研究利用PCR技术扩增水稻着-c op基因(Os着-c op 1)的ORF(开放阅读框),并克隆到原核表达载体pET-23d上,将表达载体pET-Os着-cop1转入大肠杆菌BL21(DE3),以1.0 mmol/L的IPTG (isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达重组蛋白,然后以重组蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE电泳分析结果表明,成功诱导表达了分子量约为35 kD的重组蛋白,Western blot检测表明,免疫家兔的抗血清与水稻幼穗总蛋白杂交信号较好。Os着-COP1抗体的制备有助于研究该基因及COPI小泡在水稻中的功能。     

水稻中类受体蛋白激酶FERONIA-like Receptor 1的表达纯化及抗体制备

类受体蛋白激酶参与调控植物的器官发育和抗逆性,是一种重要的蛋白激酶。通过对水稻中类受体蛋白激酶家族成员FERONIA-like receptor 1 (FLR1)进行蛋白质结构预测分析,发现FLR1蛋白具有跨膜结构,其N端在细胞膜外(FLR1-BW, 1～450 aa), C端在细胞膜内(FLR1-BN, 474～892 aa)。为了得到FLR1抗体用于其功能分析,将FLR1的N端和C端分别构建到原核表达载体pET-32a、pGEX-4T-1、pET-22b、pTriEx-4上,比较FLR1-BW和FLR1-BN在不同载体和不同条件下的表达效果。结果显示:FLR1-BW在pET-32a及pGEX-4T-1中能够有效表达,最优条件为16℃/16 h、0.5 mmol/L IPTG;而FLR1-BN蛋白表达后会对大肠杆菌产生细胞毒性,但在293细胞中能够表达。进一步利用纯化的FLR1-BW蛋白制备FLR1多克隆抗体,结果显示该抗体特异识别FLR1蛋白。本研究为类受体蛋白激酶的抗体制备提供了良好的思路并为研究FLR1功能奠定了基础。     

蛋白质印迹技术升级版（WB 2.0）的概念与设想

蛋白质印迹技术(Western blot,WB)基于抗体的特异性了解蛋白质的表达特征.该技术已经成为生命科学基础与应用研究的最常用技术之一.但目前WB手工操作多、实验流程难规范、一般只能用于同一WB分析内不同样品中目标蛋白质丰度的定性或相对定量,难以在不同实验室间进行WB数据比较.本文简要回顾了WB发展的历程,提出了升级版蛋白质印迹(WB 2.0)的概念,介绍了包括数字化、标准化、自动化、微量化、通量化以及基于内参的归一化建立数据库等为核心内容的设想.展望了WB 2.0的应用前景,提出在WB 2.0技术大规模应用的基础上,逐步建立开放的蛋白质表达特征数据库,成为继基因组、转录组等数据库之后生命科学领域的又一支撑平台.     

水稻类Tubby蛋白质在叶片生长和白叶枯病抗性反应中的表达

类Tubby蛋白质（Tubby-like protein,TLP）在动植物中广泛存在,暗示其在生命过程中发挥重要的作用。水稻（Oryza sativa）基因组中有14个TLP家族成员,首先制备了这些蛋白质的抗体,用免疫印迹方法检测了它们在水稻叶片不同生长时期的表达情况,揭示其表达模式;然后对Xa21介导的水稻白叶枯病抗性反应不同时间点进行检测,发现OsTLP2、OsTLP7、OsTLP8和OsTLP9等4个蛋白质的表达发生了变化;进一步比较它们在抗病、感病反应和对照处理中的表达情况,发现不同反应间的表达也有区别。该研究结果为阐释水稻TLP在叶片生长过程中的功能,尤其是在水稻-白叶枯病菌互作过程中的作用提供了重要线索。     

蛋白质与抗体微阵列及其在生物医学研究中的应用

随着人类基因组测序的顺利完成及其他相关领域如机械制造、微电子加工技术及生物信息学方面所取得的进展,以蛋白质为研究对象的蛋白质组学愈显重要,高通量的蛋白质与抗体阵列芯片分析技术正日益为人们关注.对蛋白质分析策略及以阵列为基础的蛋白质芯片分析原理、相关的制备方法与检测技术及其在生物学研究、医学与实验诊断应用方面进行了阐述,并对现阶段该技术存在的不足与发展前景进行了讨论.     

水稻氮饥饿诱导基因的克隆与表达分析

为了解水稻(Oryza sativa L.)对氮饥饿反应的分子与基因背景,利用RaSH策略构建了水稻氮(N)饥饿诱导cDNA文库.通过反向Northern筛选该文库,获得氮饥饿诱导的18个功能已知基因和2个功能未知基因.这些已知基因涉及碳代谢、次生代谢产物合成、蛋白质分解代谢、激素代谢、信号转导、生长调控过程及转录因子.这些基因表现出不同的时空表达模式.研究结果表明了植物对氮饥饿反应涉及互相关联的多种生理与分子机理,提供了相关的一些基因信息.     

用抗体稳定活性蛋白质的研究进展

蛋白质类药物在体内的半衰期短,主要原因是体内蛋白酶降解。利用抗体稳定活性蛋白质是一种较有前途的解决方法。本文介绍该方法的理论基础,以及随着抗体技术的进展（血清多克隆抗体→单克隆抗体→基因工程抗体）而提出的新的研究策略,这将为抗体稳定活性蛋白质开辟一条新的途径。     

水稻抗旱耐盐蛋白质组学研究进展

抗旱耐盐是水稻抗逆研究的重要方向。水稻抗旱耐盐蛋白质组学研究通过观察水稻在干旱和盐胁迫条件下的蛋白质组表达情况,动态分析水稻的蛋白质组变化,使研究的结果和性状联系更紧密,相对于从基因组水平上研究更具实际意义。简要介绍了水稻蛋白质组研究的基本方法和技术并重点叙述了水稻抗旱耐盐蛋白质组研究取得的成果。