外显子组测序技术在人类疾病研究中的应用

外显子组测序是针对基因组中的蛋白质编码区,靶向富集外显子区域测序,以发现疾病相关遗传变异的技术。该技术近年越来越多地应用于发现人类基因组低频变异、鉴定单基因遗传病致病基因和肿瘤等复杂疾病易感基因研究,成为人类疾病相关变异研究的重要工具。综述了外显子组测序技术的基本原理及其在人类疾病相关基因研究中的应用。     

高通量测序技术及其应用

高通量测序技术是DNA测序发展历程的一个里程碑,它为现代生命科学研究提供了前所未有的机遇。详细介绍了以454、Solexa和SOLiD为代表的第二代高通量测序技术,以HeliScope TIRM和Pacific Biosciences SMRT为代表的单分子测序技术,以及最近Life Science公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGM)测序技术等高通量测序技术的最新进展。在此基础上,阐述了高通量测序技术在基因组测序、转录组测序、基因表达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域的应用。最后,讨论了高通量测序技术在成本和后续数据分析等方面存在的问题及其未来的发展前景。     

用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法的建立

文章旨在建立一种基因组目标靶序列捕捉文库的方法,并结合第二代测序技术,以实现候选基因区段的深度测序。利用Agilent公司的eArray在线平台,对1250个基因的11824个外显子共2414977bp的基因组序列进行120个碱基长度的捕捉探针(钓饵)设计,并制备成SureSelect液相靶序列捕获试剂。选用2例人基因组DNA,超声打断后末端补平并磷酸化,连接SOLiD接头,回收150bp～200bp的DNA片段,与靶序列探针杂交捕获目标序列,油包水微乳滴PCR扩增后,磁珠分离富集,上SOLiD测序系统通过工作流程分析(WFA)进行文库质量的评价,或正式测序反应。结果显示对所包含的11147个基因外显子片段设计出并合成了46509个捕捉探针,制备成SureSelect试剂盒。探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段,定量PCR显示富集效率可达29倍。WFA分析表明文库可以在SOLiD仪器进行正式测序。测序结果显示靶序列区域的测序数占有效总测序数的比例达到70%,覆盖率均在200×以上。结果表明本研究所建立的SureSelect基因组靶序列捕捉、富集建立测序文库的技术路线可行,可直接用于SOLiD测序仪的测序。     

外显子组测序在人类疾病中的应用

据估计,约85%的人类遗传变异集中在蛋白编码区,因此对全部的蛋白编码区（外显子组）进行重测序,可以快速、有效地鉴定人类疾病遗传变异。以往鉴定孟德尔遗传病的致病基因多采用连锁分析结合候选定位克隆的方法,不仅耗时长,而且成功率低。2009年,科学家第一次应用外显子组测序在4名弗里曼谢尔登综合征（常染色体显性遗传病）中发现了位于MYH3中的点突变,显示出外显子组测序在孟德尔遗传病致病基因鉴定中的强大功效。就复杂疾病而言,传统的关联研究,包括全基因组关联研究（GWAS）,虽然鉴定了大量的常见变异,但对低频变异和罕见变异的检测能力十分有限;深度测序的发展为解决上述问题提供了良好的契机。本文就外显子组测序在人类疾病中的应用作一简要综述。     

高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用

转录组是指组织或者细胞在某一特定状态下转录出来的所有RNA的集合。高通量第2代测序技术使转录组学的研究模式发生了巨大的改变,所衍生出的转录组测序迅速成为研究非模式生物的先进技术。转录组测序能够在整体水平上探究细胞内基因表达的种类和数量,揭示在特定条件下机体生理生化发生过程以及其中的分子机理。本文简要阐述了转录组测序技术的基本概念、技术流程与原理,详细介绍了转录组测序在解决鳞翅目昆虫的分类、毒理、发育、与寄主互作以及非编码RNA调控等问题上做出的贡献,并对该技术现存的困难进行了系统的阐述并对其未来的发展趋势作出了简要的预测与剖析。     

基于高通量测序的麦红吸浆虫转录组分析

麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana(Gehin)是一种世界性的小麦害虫。为获得其转录组信息,本研究采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq TM 2000对麦红吸浆虫成虫转录组进行测序。共获得转录组样本数据量为27.88 G,经分析共获得59257个Unigenes,总长度49861164 bp,最短20 bp,最长29282 bp,平均长度841 bp。将Unigenes序列与NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、GO和KOG数据库进行比对(e≤10-10),共获得95029个结果。通过GO功能分类,共有19584个Unigenes在GO数据库中细胞组分、分子功能和生物学过程等3大类50个功能组中找到对应。与KOG数据库进行比对,共有11279个麦红吸浆虫Unigenes被注释,按功能大致可分为26类。通过KEGG pathways分析,共有9110个麦红吸浆虫Unigenes被注释,分别归属于细胞进程、环境信息进程、遗传信息进程、新陈代谢和有机体系统5大类代谢途径,主要包括细胞生长与死亡、细胞运动、信号转导、能量代谢等32类代谢途径。CDS预测发现30088条序列可被编码,占全部基因的50.78%。SSR位点查找发现,在59257个Unigenes中共找到36323个SSR位点,发生率为61.30%。本研究获得的巨大的麦红吸浆虫转录组信息,为麦红吸浆虫的功能基因挖掘提供了重要的信息资源。     

单细胞转录组高通量测序分析新进展

细胞异质性是生物组织的普遍特征。常规转录组测序(RNA-Seq)技术需要上万个细胞,所测结果实际上是一群细胞基因表达的平均值,所以难以鉴别细胞之间基因表达的异质性。单细胞RNA-Seq技术的分辨率精确至单个细胞,为辨别异质性群体中各种细胞类型的转录组特征提供了有力的工具。近年来单细胞RNA-Seq技术发展迅速,在方法学上包括cDNA扩增方法的多样化、对灵敏度和技术噪声的定量分析、浅覆盖高通量单细胞RNA-Seq方法和原位RNA-Seq技术等;在技术应用方面应用范围从早期胚胎发育扩大到组织器官发育、免疫和肿瘤等多个领域。文章对单细胞RNA-Seq在方法学和技术应用两方面的研究进展进行了详细阐述。     

基于高通量测序的玉米象转录组分析

玉米象Sitophilus zeamais是一种世界性的储粮害虫,但其基因信息尚不完善.本研究利用高通量测序平台Illumina HiSeq TM2000对玉米象成虫进行转录组测序,总计获得64358条unigenes,总长度39481752 bp,最短201 bp,最长29046 bp,平均长度613 bp.将unigenes序列在7大数据库Nr、GO、Swissprot、KOG、Pfam、KEGG、TrEMBL中进行注释,分别有25271、20747、16477、12060、9471、3370、25500条unigenes获得注释.通过GO功能分类,共有20747条unigenes在GO数据库中生物学过程、细胞组分、分子功能3大类68个亚类功能组中找到对应.KOG结果显示,12606条unigenes归到25个基因家族.通过KEGG代谢通路分析,共有3370条unigenes被注释,分别归属于细胞进程、环境信息进程、遗传信息进程、新陈代谢和有机体系统5大类代谢途径,共33个亚类274个功能通路.进一步的数据分析,共鉴定出146081个SNP位点和5002个简单序列重复(SSR)位点.本研究获得的玉米象转录组信息,为玉米象的功能基因挖掘提供了重要的信息资源.     

高通量测序在可变剪接中的研究进展

在真核生物基因表达的过程中, mRNA的可变剪接(alternative splicing, AS)导致同一基因蛋白质亚型多样性的产生,同时也增加了基因表达调控的多样性。高达95%的人类基因可以通过AS来产生具有不同功能的蛋白质。除此之外,约15%的人类遗传疾病和癌症与AS相关。作为一种精密的基因表达调控方式, AS协助完成重要的生物过程,如细胞发育和分化等。近年来,高通量测序的发展推动了AS在分析组织特异性基因表达领域的研究。然而,两者的有机结合应用仍然具有挑战性。该文总结了高通量测序在AS研究中的应用,进一步分析了其中存在的问题,并提出了解决方法,为推动该领域的发展提供了新的策略与思路。     

外显子捕获法分离FRAXA位点的新表达序列

外显子捕获是近年发展起来的一种自基因组DNA分离表达序列的有效方法.我们采用以pSPL3为剪接载体的外显子捕获系统,从覆盖FRAXA位点的酵母人工染色体YAC209G4中分离到2个新外显子序列A91和D12.A91在人胎肝和骨骼肌文库中丰度较高,在肝、肾和骨髓文库中也有PCR扩增.而D12在所分析的8个cDNA文库中均未见PCR扩增产物.从骨骼肌文库中克隆到一段包含A91的315 bp的cDNA(AM4470).多种组织RNA印迹显示,AM4470与骨骼肌和心脏mRNA杂交,转录本长度均为2.8 kb.     

基于新一代高通量测序的环境微生物转录组学研究进展

环境微生物转录组学是一门新兴学科,它以复杂环境样品中的微生物mRNA为研究对象,利用近年兴起的RNA-Seq高通量测序技术,在整体水平上对环境微生物的基因表达水平和调控规律进行研究.本文概述了环境微生物转录组研究从样品的采集保存、RNA提取、mRNA的富集、cDNA合成直到高通量测序及数据分析的基本流程.总结了该技术面临的主要瓶颈:环境样品mRNA含量低、腐植酸等干扰杂质多、rRNA去除程度有限.针对RNA的提取、纯化以及mRNA的富集这些重点步骤,详细阐述了近年来在提高mRNA的得率与纯度上的方法学进展.重点介绍了高通量测序数据的处理及分析方法,从测序数据的质量控制、序列组装、rRNA的鉴定及去除、功能基因注释及分类到差异表达基因的鉴定.最后总结了近年来环境微生物转录组学在新基因的发现、不同环境条件下微生物的基因表达及调控规律研究、有机物的代谢路径分析等3个主要研究领域的广泛应用.随着测序技术及生物信息学分析工具的发展进步,环境微生物转录组学将具有更广阔的应用前景.     

基于高通量测序技术马肠道菌群研究进展

马肠道非常发达,其中定居着丰富又复杂的微生物菌群,这些微生物在宿主的生理、代谢、营养和免疫功能等方面有着重要作用.基于高通量测序的宏基因组学技术和分析手段的改进,对复杂环境中微生物的研究更加方便、透彻.本文就基于高通量测序的宏基因组技术在马肠道核心菌群、不同肠道段菌群结构、不同因素对肠道菌群结构的影响,以及马肠道微生物...     

基于高通量测序的慈竹笋转录组分析与基因功能注释

慈竹是我国四川当地的优势丛生竹种之一,其纤维长度和质量较优异,是造纸、纺织等工业的良好原料。本文利用Illumina Hi SeqTM 2000平台,对10、50、100和150 cm高的慈竹笋进行转录组分析,共得到69.28 M条读长(Reads),经从头拼接、组装和聚类后得到111 137条非重复序列基因Unigene,其中共有63 094条注释到COG、GO、KEGG、Swiss-Prot和Nr数据库中。这些Unigene不仅具有一般的功能,如转录和信号转导等,还涉及到蔗糖转运与代谢、次级代谢产物及细胞壁的生物合成等方面。不同高度慈竹笋的纤维素合成酶基因存在差异表达,发现了可能调控慈竹生长发育以及纤维素和木质素生物合成的相关基因,为慈竹品种改良提供一定的理论基础。     

应用全外显子组测序筛查一高原肺水肿家系易感基因

高原肺水肿(high-altitude pulmonary edema, HAPE)是一种高原特发性疾病,其发病与遗传因素有一定关联。本研究对一个HAPE相关的家系展开遗传学调查,然后利用外显子组测序筛查了包括先证者在内的6名HAPE病史成员以及先证者的母亲共7个成员的遗传变异,结果发现18个HAPE相关的潜在遗传变异(9个SNVs和9个Indels)。利用SIFT,PolyPhen-2和PROVEAN等3种软件对这些遗传变异进行蛋白功能危害性分析,结果发现定位于CFHR4基因的SNV(p.L85F)以及定位于OXER1基因的SNV(p.R176C)具有高危害性,且OXER1的功能与HAPE低氧诱导通路存在高度关联,它们可作为该家系中HAPE相关的候选病理性变异。此外,还有部分SNVs(NMB p.S150P、APOB p.I4194T和EIF4ENIF1 p.Q763P)以及Indels(KCNJ12 p.EE333-334E、ANKRD31 p.LMN251-253LN和OR2A14 p.HFFC175-178HFC),其遗传变异同样具有一定危害,可作为潜在的HAPE相关遗传变异。本研究首次通过外显子组测序直接筛选与一中国HAPE家系相关的遗传变异,为后续揭示HAPE发病机制提供了新线索。     

基于高通量测序的发芽苦荞转录组学研究北大核心CSCD

采用新一代高通量测序技术Illumina Solexa Hiseq 2500对发芽荞麦转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了42 953 962个序列读取片段(reads),包含了5.37 Gb碱基序列信息。对reads进行序列组装,获得45 278个单基因簇(unigenes),平均长度862 bp,序列信息达到了39 Mb。另外,从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigenes进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,2 127个unigenes与其他生物的己知基因具有不同程度的同源性。发芽苦荞转录组中的unigenes与细胞进程、细胞和蛋白结合相关。将unigenes与KOG数据库进行比对,根据其功能大致可分为24类。以KEGG数据库作为参考,依据代谢途径可将unigenes定位到328个代谢途径分支,包括核糖体代谢通路、碳水化合物代谢等,并且筛选出38条参与GABA合成的氧化磷酸化代谢的unigenes。SSR位点查找发现,从71 366个unigenes中共找到7 141个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是AAG/CTT和AT/AT。     

高通量测序序列比对研究综述

高通量测序技术的飞速发展,给生物信息学带来了新的机遇和挑战,第二代测序序列数量多、长度短使得原来的序列分析手段不再适用。近几年来,针对高通量测序的序列分析算法和软件日益增多,目前已有上百种,导致选择合适的软件成为一个难题。对第二代测序的测序类型、序列类型以及分析算法进行了总结和归纳,对现今常用的分析软件的序列的类型、长度以及软件应用算法、输入/输出格式、特点和功能等方面做了详细分析和比较并给出建议。分析了现今测序技术和序列分析存在的问题,预测了今后的发展方向。     

牛全基因组高通量测序技术研究进展

现代科技迅速发展的今天,无疑是分子生物学的世界。基因组测序是对生物的遗传结构进行分析的一种技术。作为一项尤为重要的生物技术。在近几年来得到了迅猛的发展以及应用,并取得了跨越性的进展,在很多领域取得了革命性的成就。无论是在人类疾病的防治,还是在畜牧遗传育种发面都发挥着重要的作用。本综述主要介绍了第一代测序技术、第二代测序技术以及第三代测序技术的原理,并对三者的优缺点进行了比较说明,还分别阐述了全基因组高通量技术在肉牛的起源、遗传育种与优良性状的选育和奶牛的疾病防治、生产性能的提高等方面的研究进展,对当下的高通量测序技术存在的问题进行了讨论,并对其未来进行了展望。     

高通量测序技术在遗传性耳聋研究中的应用及研究进展

耳聋是一种常见的严重出生缺陷,阐明遗传性耳聋的致病机理不仅能够在临床上辅助诊断,为遗传咨询及耳聋预防提供依据,而且能促进人们更深入地了解耳聋的致病机制,开发新的治疗方法。随着基因组研究技术不断创新,以全基因组测序、全外显子组测序、目标区域测序为代表的高通量测序技术在遗传性耳聋研究中已得到广泛应用。本文总结了近5年全外显子组测序和目标区域测序在遗传性耳聋致病基因研究及临床分子诊断中应用及研究进展,希望能够有助于我国临床耳聋基因诊断技术的发展及诊断水平的提升。     

小花草玉梅高通量转录组测序与花发育基因的挖掘

该研究采用高通量测序技术Illumina HiSeq 2000,对小花草玉梅花器官进行转录组测序,挖掘参与其花发育相关的基因。测序结果得到54 513 822个序列读取片段(reads),包含7 826 726 115bp的碱基序列信息。将测序数据进行序列组装后,获得43 767个单基因簇(unigenes),平均长度为926bp。转录物注释结果显示,28 130条unigenes有同源比对信息。在43 767条unigenes中检测到5 015个SSR位点,且SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的是AG/CT,其次是AAG/CTT和ACC/GGT。通过转录因子分析,进一步筛选得到了12个与花发育紧密相关的MADS基因,分别为FUL1,FUL2,AP3-1,AP3-2,AP3-3,PI1,PI2,AG1,AG2,SEP1,SEP3和AGL6。实时荧光定量PCR分析表明,与小花草玉梅正常花相比,全白、绿白相间、五瓣变异、全绿变异花中的FUL1、SEP1,SEP3和AGL6基因均显著上调表达,而12个基因在极端变异花中的表达水平与正常花的差异均不明显。定量结果经主成分分析显示,AGL6、SEP3、FUL1、PI2及SEP1的表达量均为小花草玉梅花形态建成的主要指标。研究结果在一定程度上丰富了小花草玉梅的基因信息,为后续研究其花器官变异的分子机制提供了基础数据。