非病毒载体聚乙烯亚胺介导DNA转染的研究

目的 研究新型非病毒类载体聚乙烯亚胺（PEI）的最适转染条件.方法 分析各种因素对25ku线性PEI转染效率的影响,优化实验条件.结果 PEI与DNA的质量比≥2能保证DNA与PEI完全结合,最佳混合时间为10 min,但血清的存在将降低其结合效率.在一定范围内提高PEI与DNA的质量比有利于提高转染效率.293T细胞最适转染密度为培养面积的80%.结论 确定了PEI转染细胞的最优条件.     

新型聚乙烯亚胺衍生物体内转染活性的研究

目的:研究新型聚乙烯亚胺衍生物作为基因载体在小鼠体内的转染活性情况。方法:采用荧光素酶质粒DNA作为报告基因,与基因载体复合,对小鼠尾静脉注射,考察组织分布情况;以及对小鼠肌肉注射,应用活体成像技术考察其转染活性。结果:静脉注射后,小鼠肺组织中基因表达量最高;肌肉注射后,可以观察到活性转染结果,表达量高于对照PE(?)25KDa。结论:新型聚乙烯亚胺衍生物在体内可成功输送质粒DNA,但转染效率偏低。     

纳米金-聚乙烯亚胺基因载体的制备

目的:基因方法治疗癌症近年来取得了很大的突破,因此基因载体的构建显得尤为重要.其中纳米基因载体合成简单,成本低廉,并能够包裹、浓缩、保护核苷酸使其免受核酸酶降解,因此纳米材料广泛地应用于基因输送.我们拟开展聚乙烯亚胺-纳米金基因载体的制备及其表征.方法:采用层层包裹技术制备基因载体,首先通过柠檬酸钠还原法制备纳米金颗粒后,应用11-巯基十一烷酸对金颗粒进行修饰,使其表面带有羧基,然后进一步将带有氨基的低分子量聚乙烯亚胺与羧基进行连接.应用动态光散射(DLS),紫外可见光谱(UV)和透射电子显微镜(TEM)对构建的纳米基因载体进行表征.结果:成功制备了聚乙烯亚胺-纳米金基因载体,检测表明每一步制备出的产物纳米尺寸在20-30nm之间,液体均匀稳定,分散系数(PDI)在0.2以下,Zeta电位测定表明,每步的产物电荷变化与外层包裹的反应物有关.尽管金颗粒外层包裹聚乙烯亚胺,但是总体上纳米载体尺寸没有发生太大的变化,TEM检测表明每一步形成了均匀的、单分散的、球状的纳米颗粒.结论:我们通过层层包裹技术成功制备了聚乙烯亚胺-纳米金基因载体,在进一步开展的生物活性的检测中,希望通过纳米载体的携带作用,将基因转染进靶细胞,从而检测相关基因对靶细胞的沉默作用,提高基因药物的应用,为开发新型基因药物提供基础.     

骨髓间质干细胞定向分化的研究进展

骨髓间质干细胞是多能细胞 ,可分化成为间质组织 ,包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质。在体外培养时 ,细胞贴附生长 ,呈成纤维样细胞表型 ,通过诱导可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌肉细胞等。本文综述间质干细胞在体内和体外定向分化的研究进展 ,并探讨其应用前景。     

人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺体外靶向转染肿瘤细胞

为了提高聚乙烯亚胺(Polythylenimine,PEI)类载体对肿瘤细胞的靶向性同时降低其细胞毒性,先用1800DaPEI制备了交联低分子量PEI,然后将人转铁蛋白与之偶联,得到了新型肿瘤靶向性人转铁蛋白偶联交联聚乙烯亚胺基因载体(TCP)。对所得的TCP的理化特性经行了表征,并检测了其细胞毒性。采用TCP介导pGL-3和pEGFP分别对293T、HepG2和Hela细胞系进行体外转染实验。结果表明:TCP是一种低毒高效的基因载体,在肿瘤细胞中的转染效率显著增强,因为其二硫键可在细胞内还原降解,而且通过偶联的转铁蛋白配体与肿瘤细胞表达的转铁蛋白受体间的相互作用,可增强该载体对肿瘤细胞的转染效率和靶向性。     

交联聚乙烯亚胺衍生物的构建及其转染COS-7 细胞的研究

目的:优化构建交联聚乙烯亚胺(Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对非洲绿猴肾成纤维细胞系(COS-7)的转染活性和细胞毒性。方法:以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力,MTT法检测PEI-Bu对COS-7的毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/DNA复合物在COS-7细胞的转染活性。结果:凝胶电泳表明PEI-Bu/DNA在质量比大于1时即具有复合DNA的能力,PEI-Bu的细胞毒性随浓度增大而增大,在同一浓度下PEI-Bu的细胞毒性小于PEI 25kDa,(P<0.05),PEI-Bu/DNA在质量比为5时达到最高转染活性,高于PEI 25kDa(P<0.01),并与Lipofectamine2000相当(P>0.05)。结论:PEI-Bu在COS-7细胞中是一种低细胞毒性、高转染活性的非病毒基因载体(与商业化的PEI 25kDa比较),其在基因治疗领域中具有潜在的应用前景。     

纳米羟基磷灰石表面修饰及其转染细胞的研究

目的:探讨羟基磷灰石-聚乙烯亚胺(nHA-PEI 10KD)纳米颗粒的癌细胞基因转染效率.方法:通过透射电子显微镜(TEM)观察HA-PEI(10KD)纳米颗粒的形态及粒径,Zeta电位仪测定nHA-PEI和HA在酸、碱、中性环境中的电位,用琼脂糖凝胶电泳检测nHAP-PEI(10KD)与DNA结合的能力,MTT比色法检测nHAP-PEI(10KD)对nepG2细胞的毒性,选用增强型绿色荧光蛋白质粒pEGFP1与nHA-PEI结合后,分别转染真核细胞HepG2、Hela、SW620,计算其转染率.结果:nHA-PEI(10KD)分散程度好,粒径60-80nm,在PH7.2时,Zeta电位42.87mV,能转染实验中的细胞,转然效果最好的是HepG2细胞,其次Hela、SW620,转染率高于PEI(10KD)、nHA,但低于脂质体.结论:通过阳离子PEI修饰HA,可有效将增强型绿色荧光蛋白质粒转入HepG2细胞,HA-PEI(10KD)纳米颗粒复合物有望成为基因传递的有效栽体.     

非病毒型载体介导基因转染

基因载体是制约基因转移技术发展的关键。近年来,非病毒载体由于其安全、低毒、低免疫原性等特点而备受青睐。文章以脂质体和聚乙烯亚胺为代表,介绍了非病毒载体的性质、介导转染的机制。随着人们对细胞转染机制了解的深入以及生物材料科学的迅速发展,非病毒型载体将有望实现高效、低毒、靶向特异等特点,从而成为基因治疗中的理想载体。     

增强型绿色荧光蛋白基因电穿孔转染骨髓间充质干细胞的研究

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养方法,探讨电穿孔法介导外源基因转染骨髓间充质干细胞的可行性及转染效率.方法 Ficoll-PaqueTMPlus淋巴细胞分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)并进行原代培养和传代扩增,免疫组化的方法对其初步鉴定.用荧光显微镜、细胞计数法和流式细胞仪分析转染效率.结果电穿孔法可较高效转染rMSCs,转染率为(32.8%±3)%.该条件下电转染后的MSCs其生长曲线与转染前的细胞比较无明显变化.结论优化条件的电穿孔法具有较高的介导外源基因表达于rMSCs的效率,且对rMSCs的生物学行为没有明显影响.     

骨髓间质干细胞修复受损心肌研究进展

骨髓间充质干细胞是一种多潜能干细胞。在体外培养时,多种诱导因素可使其分化为心肌细胞等。目前进行的动物实验和临床研究表明骨髓间充质干细胞具有促进血管增生以及改善心肌梗死后心脏功能的作用,为受损心肌的治疗提供了广阔前景。但是其修复受损心肌的机制仍具有很大争议。本文就以上内容进行综述。     

新型聚乙烯亚胺衍生物在Hep G2 细胞中转染和毒性的研究

目的:研究以对苯二甲醛( Terephthalaldehyde)为连接剂的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)衍生物PEI-Tp对肝癌细胞Hep G2的转染活性和细胞毒性的影响.方法:以荧光素酶质粒作为报告基因,研究高分子和DNA的复合物在Hep G2细胞中的转染活性,用MTT的方法研究高分子对Hep G2细胞的毒性.结果:Hep G2细胞转染结果显示构建的聚乙烯亚胺衍生物PEI-Tp具有高效输送质粒的能力;细胞毒性结果显示PEI-Tp随着浓度的增加,其毒性显著低于PEI25 kDa.结论:Hep G2细胞实验数据显示PEI-Tp是一种高效、低毒,在基因治疗领域有相当前景的非病毒载体.     

中老年人骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的:研究中老年人骨髓间质干细胞(MSCs)的生物学特性。方法:用Ficoll-Paque分离不同年龄段供者MSCs体外培养,进行诱导分化,用流式细胞术检测表面标志,核型分析观察细胞染色体的稳定性,裸鼠实验、软琼脂实验观察致瘤性。结果:中老年人每毫升骨髓分离的单个核细胞量和MSCs增殖速度与青年人无显著差异;中老年人不同代次的MSCs诱导后具有向成骨细胞和成脂细胞分化的能力;分离培养的MSCs表达CD44,不表达CD34;传至第10代核型未见异常,未见致瘤性。结论:中老年人MSCs有较强的体外增殖能力和多向分化潜能,遗传背景稳定。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

为建立hVEGF165基因转染大鼠间充质干细胞的方法．采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC,并测定其生长曲线和表面标志CD34、CD44、CD45及SH3,然后向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化;用脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165转染BMMSC,观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过RT-PCR、Western和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况．经培养的大鼠BMMSC,CD44、SH3检测为阳性．CD45、CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR、Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF165基因转染至大鼠BMMSC中,并获得有效的表达．真核表达栽体pcDNA3.1-hVEGF165在BMMSC中获有效表达,为VEGF基因转染BMMSC移植对心梗后大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据．     

聚乙二醇化学修饰的聚乙烯亚胺衍生物的制备及其细胞毒性研究

目的:合成聚乙二醇(PEG)化的聚乙烯亚胺衍生物(PEI-Et)基因输送载体PET 1和PET 2,并考察两个载体材料在He La细胞、MCF-7细胞中的细胞毒性及在He La细胞中的转染效率。方法:将亚乙基二氯甲酸酯与PEI 800 Da交联制备成交联PEI衍生物PEI-Et,进一步将PEI-Et与聚乙二醇(PEG)以不同摩尔比例(1:1,2:1)交联连接,得到PEG化的PET 1和PET 2。采用MTT法检测PEI-Et、PET 1、PET 2对He La细胞、MCF-7细胞的细胞毒性。检测单位质量的荧光强度测定转染效率。结果:PET的细胞毒性随浓度增大而增大,在同一浓度下PET的细胞毒性小于PEI 25 KDa(P0.01);并且与DNA复合后,复合物细胞毒性随质量比的增高而增大,在同一质量比下PET的细胞毒性小于PEI 25 KDa(P0.01),特别是PET 1。并且最佳比例时,PET 1的转染活性最高。结论:作为非病毒基因载体,PET 1具有高的转染效率及低的细胞毒性。     

用聚乙烯亚胺反向转染siRNA表达盒进行RNA干扰的研究

目的:建立适用于大规模RNA干扰(RNAi)筛选的siRNA生成与导入技术。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)为模型,用PCR方法生成了包含U6启动子、互补的反义链和正义链以及终止序列的特异性siRNA表达盒(SEC),对聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染SEC的方法及其效率进行研究。结果:PEI对细胞的毒性呈剂量依赖关系,当PEI与DNA的N/P=7.53,即PEI与DNA等量时,转染效率达到最高。PEI与脂质体LipofectAMINETM2000的转染效率无显著差异(P>0.05),对SEC的转染效率显著高于质粒载体(P<0.01)。反向转染的转染效率显著高于常规转染(P<0.01)。利用PEI将表达GFP特异性siRNA的SEC反向转染可稳定表达GFP的HeLa细胞株(HeLa-EGFP),荧光染色和Western印迹检测均表明可显著抑制GFP的表达。结论:PEI介导的SEC反向转染具有简便、快捷、经济的优点,可满足大规模RNAi筛选的需要。     

骨髓间质干细胞向大鼠损伤心肌组织的迁移

实验旨在动态观察骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向不同微环境下心肌组织的迁移特点,明确组织损伤在干细胞迁移中的作用,为提高干细胞治疗的靶向性和高效性奠定初步试验基础。分离纯化雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠的骨髓MSCs,输注入雌性SD大鼠。实验分为4组：正常大鼠＋MSCs移植组,假手术＋MSCs移植组,心肌缺血＋MSCs移植组,心肌缺血对照组（心肌缺血＋培养基移植）。结扎冠状动脉前降支制造心肌缺血模型,将相等数量的雄性MSCs经尾静脉注射移植入前3组雌性大鼠体内,对照组注射等体积培养基,分别于移植后1周及8周取心脏组织标本,采用荧光原位杂交方法（fluorescence in situ hybridization,FISH）检测大鼠Y染色体雄性鉴别基因sty片段的表达,用透射电镜观察大鼠心肌组织超微结构改变。结果发现,移植后1周和8周,正常大鼠移植组和对照组大鼠的心肌组织中均未见sry基因的表达,但假手术移植组和心肌缺血移植组的心肌组织中均可见sty基因的表达,心肌缺血移植组的Y染色体sty基因阳性细胞数量在两个时间点均显著高于假手术移植组（P〈0．01）。分别比较心肌缺血移植组和假手术组在移植后1周和8周的Y染色体sry基因阳性细胞的数量,两个时间点无明显差异。心肌组织的超微结构观察发现心肌缺血移植组大鼠的心肌梗死周边区域可见一些细胞,其形态类似于体外培养的MSCs。研究结果提示MSCs具有向损伤心肌组织迁移的特性,迁移的高峰期可能在组织损伤1周左右,组织损伤及其程度在干细胞迁移中起重要作用。     

慢病毒载体介导Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死

为研究经Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)对脑梗死的协同治疗作用, 构建带有大鼠Bdnf基因之慢病毒载体, 并感染大鼠骨髓间质干细胞(Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)。运用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型, 经尾静脉注射移植, 对照组注射0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL, Bdnf-rMSCs和Mock-rMSCs组分别注射Bdnf-rMSCs细胞悬液以及未插入目的基因的空病毒载体感染后的rMSCs细胞悬液各1 mL。各组大鼠分别于术后24 h、移植后2周及2月应用modified Neurological Severity Scores (mNSS)评价神经功能状况。结果显示, 与对照组相比, Mock-rMSCs及Bdnf-rMSCs移植组神经功能改善明显, mNSS评分差异有统计学意义(P<0.001), 而且Bdnf-rMSCs移植组明显优于Mock-rMSCs移植组(P<0.001)。移植后2周及2月, 与对照组相比两移植组梗死区脑组织结构恢复较好, 均可见EGFP阳性细胞在梗死区及其周边区聚集并存活, 并有部分细胞出现神经元样改变。Bdnf- rMSCs移植组中移植细胞大量表达BDNF, 两移植组中均有部分植入细胞表达神经细胞表面标志物。研究表明Bdnf基因修饰的rMSCs经静脉移植后可迁移至脑梗死灶周围, 向神经细胞分化并长期存活。移植后的干细胞可与其分泌的BDNF协同促进脑梗死后神经功能恢复, 这为将来基因工程干细胞移植治疗脑梗死提供了实验依据。     

影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素

长期的骨骼废用引起的骨质减少主要归因于骨形成的减少,成骨细胞由具有多向分化潜能的间充质细胞经骨原细胞、前成骨细胞分化而来,骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,本文综述了骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素,有助于增加对骨丢失的理解,并进行预防和治疗,为航天员和骨骼废用病人创造更健康的生活。     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞(MSCs)是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子(Bdnf)基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区(CDS)片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs(rMSCs)后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10~7TU/mL,PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

恒河猴骨髓间质干细胞的体外分离培养及形态学特征分析(英文)

探索恒河猴骨髓间质干细胞(MSC)的体外分离培养方法,为其应用提供实验基础。取恒河猴骨髓细胞悬液,经梯度离心去除大部分血细胞,取含有MSC的中间单核细胞层,在含10%胎牛血清及1ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM中培养扩增,并不断换液去除杂细胞,经过18d的原代培养,获得呈致密单层生长的MSC,其形态为较规则的长梭形细胞,排列有方向性,呈现一定的漩涡状、辐射状生长趋势。将原代细胞以1∶2传代,传代培养后期,细胞增殖速度逐渐变缓,细胞形态逐渐出现三角形、多边形及扁平宽大形等不规则形态。结果显示,恒河猴骨髓间质干细胞可在体外进行传代培养,但需进一步优化其培养条件。