一种兔肠源抗菌蛋白分离纯化及其抑菌活性

目的探讨兔肠道组织抗菌有效成分的组成及其性质。方法将新鲜兔小肠组织匀浆,经高温处理,乙酸浸提后,检测抗菌活性,再经Sephadex G100和Sephadex G75凝胶柱过滤层析,收集具有抗菌活性的蛋白组分,经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,为一条蛋白带,其相对分子质量约为43×103。用琼脂糖弥散法和活菌计数实验检测纯化物对9株细菌的抑菌作用。结果分离得到一种纯的兔肠源抗菌蛋白,纯化的兔肠源抗菌蛋白对9株细菌的均有明显的抑菌作用,杀菌率介于78%与98%之间,显示了较强的抗菌活性。结论初步显示了兔肠源抗菌蛋白在细菌性疫病的防治方面的应用前景。     

一种同时纯化钙谓神经磷酸酶和钙调素的有效方法

本文报导了一种能同时纯化钙调神经磷酸酶和钙调素的有效方法。牛脑粗提液经DE-52纤维素层析分段洗脱:0.5mol/L NaCl缓冲液洗脱峰经phenyl-sepharose亲和柱和G75 sephadex制得电泳纯钙调素。0.18mol/L KCl缓冲液洗脱峰经Affigel-Blue层析,硫酸铵盐析,钙调素亲和层析,G-200 Sephadex凝胶过滤制得电泳纯钙调神经磷酸酶。     

广西眼镜蛇蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

目的对广西眼镜蛇毒中磷脂酶A2(PLA2)进行分离纯化,测定其对肝星状细胞HSC-T6的增殖抑制作用。方法采用Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱结合的方法分离广西眼镜蛇粗毒,经平板法测定各峰的PLA2活性;经SDS-PAGE电泳鉴定终产物纯度并测定分子量,NanoLC-ESI-MS/MS鉴定其组分;CCK-8法测定PLA2对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,确定其凋亡的最小毒性浓度。结果 Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱层析法,得到第Ⅲ峰具PLA2活性,且达到电泳纯,经NanoLCESI-MS/MS鉴定其为PLA2,分子量约为14.06kD;PLA2在0~1μg/ml的浓度下对HSC-T6细胞具有一定的促增殖作用,2μg/ml时细胞数达到最大值,4~16μg/ml时对细胞生长有抑制作用,且随浓度增大细胞数降低。结论采用Sephadex G-50、CM-Sepharose CL-6B、Macro-prep High S预装柱结合的方法对广西眼镜蛇毒进行分离纯化,得到电泳纯且具PLA2活性的磷脂酶A2;广西眼镜蛇毒PLA2对肝星状细胞HSC-T6增殖有抑制作用,PLA2对HSC-T6细胞的最小毒性浓度为2μg/ml。     

蛹虫草子实体多糖的分离纯化

目的:研究人工培养蛹虫草子实体多糖的分离纯化方法.方法:多糖经脱色、醇析、除蛋白及乙醇分级沉淀,采用Seph-adex G100柱层析纯化.结果:60℃脱色9h脱色率达70.72％.醇析最优条件为:无水乙醇,24h,4倍乙醇.Sevag法抽提30min重复6次除蛋白率达84.09％;抽提lh重复3次、6次除蛋白率分别为81.14％、84.47％,多糖损失率分别为27.03％、43.16％.木瓜蛋白酶除蛋白最优条件为70℃,1:10,2h,除蛋白率为25.67％.粗多糖经乙醇分级沉淀得2种粗多糖成分,分别经Sephadex G100柱层析可进一步纯化为3种较纯多糖成分.结论:采用乙醇分级沉淀及Sephadex G100柱层析纯化粗多糖可得到3种较纯多糖成分,纯化效果较好.     

细菌(Pseudomonas maltophilia)之绒毛膜促性腺激素(hCG)结合物质之研究

 细菌(Pseudomonas moltophilia)与hCG及LH有特异的亲和力,实验发现,细菌之生长曲线与hCG结合活性成平行关系,96小时达高峰,细菌之培养液中含有可溶性结合蛋白,该蛋白经硫酸铵沉淀(80％饱和度)、Sephadex G-100柱层析、DEAE-纤维素柱0.5mol/L NaCl梯度洗脱,再过Sepharose CL-AB柱,收集之活性部分经SDS电泳测得其分子量为70,000,凝胶层析测Stokes radius为41A,Schiff氏染色未见着色带。     

两种类型聚半乳糖醛酸酶的提纯及性质

黑曲霉(AspergilluS niger)AS 3.3883所产果胶酶经DEAE Sephadex A50及Sephadex G100柱层析分离出电泳纯的两种聚半乳糖醛酸酶(PG1,PG2),并对它们的性质及结构进行了比较研究。结果证明两种酶作用的最适条件、动力学性质、分子量、氨基酸组成及金属离子对酶活力影响等方面有很大差异,但二者的每个摩尔的活力及酶的构象很相似。     

广西眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化方法

为了得到更高纯度和活性的广西眼镜蛇毒神经生长因子(never growth factor,NGF),我们对原有的分离纯化方法进行改进。采用DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱结合的方法进行分离。在分离纯化过程中,采用PC12细胞检验每一步所得结果中的NGF活性,并测定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度。经DEAE CL-6B离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S离子交换柱分离纯化后,得到的第二峰具有NGF活性,并且已达到电泳纯。经PC12细胞验证后,确定NGF诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/m L。     

霍山铁皮石斛糖蛋白的制备及抗氧化活性

以霍山铁皮石斛枫斗为试验材料,经脱脂脱色、0.3 mol/L盐溶液浸提、Sevage法脱蛋白、硫酸铵分级沉淀、透析、聚乙二醇10 000浓缩、冷冻干燥得到粗品;经SDS-PAGE电泳、DEAE 52离子柱和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到糖蛋白并测定其抗氧化活性。SDS-PAGE电泳显示硫酸铵饱和度越大,盐析作用越强,糖蛋白条带越明显,糖蛋白分子量在6.62×10~4附近;DEAE 52离子柱和Sephadex G-100凝胶柱逐步分离纯化得到2个组分的糖蛋白GP1和GP2;分光光度法测定GP1和GP2中糖蛋白含量分别约为95%和87%;抗氧化结果表明,霍山铁皮石斛糖蛋白具有较强的还原能力且可有效地清除自由基·DPPH、·OH和·O~-_2。     

狂犬病病毒重组免疫毒素的表达及其生物活性鉴定

将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29％。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96％的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。     

蜈蚣碱性蛋白SSmp—d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定

少棘巨蜈蚣经９５％乙醇脱脂后,再经４℃水冷渗,水提液低温旋转浓缩,冻干,得到的冻干粉先后经过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱,等电聚焦制备电泳,再经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０柱,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱,最后经ＨＰＬＣ制备得到一个纯的碱性蛋白,命名为ＳＳｍｐ－ｄ。该蛋白经ＨＰＬＣ、超薄等电聚焦电泳检验是均一的。采用ＨＰＬＣ和Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐａｋ＾ＴＭ１２５柱测定其分子量为２４．６４ｋＤ。ＩＥ     

葡萄糖异构酶的纯化和拉曼光谱

采用Streptomyces rosechromagenusNo.336细胞丙酮干粉,经抽提、DEAE-纤维素和DEAE-Sephsdex A-50层析,Sephadex G-200凝胶过滤,得到了电泳纯的葡萄糖异构酶,以这种均一态酶测定了其激光拉曼光谱。     

铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白LexA的复性及活性研究

目的:对LexA蛋白复性方法进行优化,对复性后的LexA蛋白的生物学活性进行分析。方法:采用含有GSH/GSSG的缓冲液,一步稀释法对变性LexA蛋白进行复性,用镍离子亲合柱及阳离子柱层析法对复性后的LexA蛋白进行纯化,再以Sephadex G-25凝胶柱脱盐,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC法检测复性效果,Western blot法分析复性前后及经DTT处理后的LexA蛋白的免疫反应性,凝胶滞留电泳试验检测复性LexA蛋白与DNA的特异性结合能力。结果:复性后的LexA蛋白出现单体和多聚体的形式,多聚体是由单条肽链聚合而成。LexA单体和多聚体与兔抗LexA多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的LexA蛋白能与SOS盒序列发生特异性结合。     

小鼠丝氨酸消旋酶的克隆、表达与纯化

丝氨酸消旋酶(Serine Racemase,SR)是一种磷酸吡多醛依赖酶,在ATP和Mg2+的辅助下,催化L型丝氨酸转变为D型丝氨酸,D-丝氨酸通过结合在NMDA受体的Gly结合位点,调节其生理功能。本文将小鼠来源的丝氨酸消旋酶基因克隆至原核表达载体pMAL-C2上,构建重组质粒pMAL-C2-SR。将重组质粒转入E.coil BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导,获得重组表达。重组蛋白带有MBP标签,经Amylose亲合柱和Sephacryl S-200纯化,获得电泳纯的目的蛋白。     

人血清高密度脂蛋白主要载脂蛋白的分离纯化及其多态现象

本文报道人血清高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白(apoHDL)的分离纯化和其多态型(Polymorphism,Isoform)的初步研究。首先用硫酸右旋糖酐沉淀,结合角度头密度梯度超速离心的方法,从人血清中提取高密度脂蛋白。分离纯化的高密度脂蛋白在0.5％琼脂糖和3.75％聚丙烯酰胺电泳中显示一条带,经0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺电泳鉴定未发现有血清白蛋白的污染。纯的HDL在低温下用醇醚混合液脱脂获得载脂蛋白(apoHDL)。经过Sephadex G-200凝胶过滤柱,apoHDL被分为五个蛋白峰。0.1％SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定表明峰Ⅰ、峰Ⅱ为载脂蛋白聚集体,主要含apoA-Ⅰ和apoE;峰Ⅲ为纯的apoA-Ⅰ;峰Ⅳ含有apoA-Ⅱ、apoC和apoA-Ⅰ;峰V主要为apoC。令人感兴趣的是,经聚丙烯酰胺等电聚焦电泳鉴定apoA-Ⅰ有八种多态型。这些结果对于深入研究载脂蛋白的结构、功能和代谢,对于研究高密度脂蛋白的亚类及其抗动脉粥样硬化的机理都是有益的。     

人胎盘酸性β-1,4葡萄糖苷酶的纯化及部分性质

 本文以正常人胎盘为材料,通过匀浆、硫酸铵分级分离、20％正丁醇抽提、Sephadex G-200凝胶过滤及Concanavalin A-Sepharose 4B亲和层析等分离纯化步骤,制备获得了纯化3705倍的酸性β-1,4葡萄糖苷酶,其比活性和获得率分别为277261.33n mol·(mg Prot·h)~(-1)和14.3％。 经agarosn-IEF检验,该纯化的酸性β-1,4葡萄糖苷酶已达蛋白电泳单点纯,PI为5.2。经3～28％梯度PAGE,求知该酶单体分子量为74kD。该纯制酶极不稳定,4℃贮存6天后活性即降低50％以上,与其特异性抗体结合后,活性全部被抑制。     

尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.7.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,菌株经诱导表达尿酸氧化酶蛋白,目的蛋白经过超声破碎,经检测以可溶性蛋白为主;菌体经超声破碎后,上清经过阴离子柱和阳离子柱两步纯化,得到尿酸氧化酶纯品,纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。结果显示:尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%;表达产物经过两步层析柱纯化,获得电泳扫描纯度为95%的纯品;在体外活性测定中具有分解尿酸的能力,在临床检测和治疗中有重要意义。     

乙酰氨基半乳糖转移酶14(GALNT14)在毕赤酵母中的表达纯化及活性鉴定

将GALNT14全长编码区克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,构建重组载体pPIC9K-T14,经电转至毕赤酵母GS115中表达,使用G418筛选高表达重组菌,并对诱导条件进行优化,表达产物使用SDS-PAGE分析、Western blot鉴定、Sephadex G-100纯化、最后经HPLC检测活性。结果显示,在提供更好的供氧量条件下,用0.75％甲醇诱导可提高目的蛋白的表达量而降低杂蛋白的表达。培养上清液经SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量约64 kDa;Western blot结果显示在相应分子量处有一条特异性条带;利用Sephadex G-100成功分离纯化了目的蛋白;活性测定结果显示所获得的目的蛋白具有催化活性,为深入研究GALNT14的结构与功能奠定了基础。     

视黄醇结合蛋白的结构与功能

视黄醇结合蛋白（RBP）是视黄醇转运的载体蛋白,作为结合小分子流水物质的载体蛋白家族（lipocalin）的一个重要成员,其结构与功能的研究正受到国外学者的重视,文章介绍了视黄醇结合蛋白的性质、结构研究进展,讨论了视黄醇结合蛋白与前蛋白和受体相互作用的位点和结构特点．     

拟南芥细胞异三聚体G蛋白的分离纯化

以拟南芥哥伦比亚Columbia(Col-0)野生型悬浮培养细胞为材料,采用超声波破碎、匀浆、离心、40%~60%饱和度硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-25脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换、Sephadex G-200凝胶过滤,最后经过Sepharose CL-6B得到纯化的目的蛋白,蛋白收率为0.097%。纯化的蛋白质经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定显示为一条带,经Western blotting证实为G蛋白。把经Native-PAGE鉴定的蛋白质的条带回收,进行SDS-PAGE显示有3条带。一条是Gα亚基,其分子量为60kDa左右;另外2条带分子量为45kDa和35kDa,可能是β、γ亚基,初步证实拟南芥中存在异三聚体G蛋白。G蛋白提取方法的建立为在基因突变型拟南芥中G蛋白功能的研究奠定基础。     

家蝇幼虫体内一种抗菌蛋白的分离纯化

30%H2O2诱导家蝇幼虫90min,继续饲喂24h后利用硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25 和Sephadex G-75两步凝胶过滤、CM-Sepharose Fast Flow弱阳离子交换的纯化方法,得到一种电泳纯的抗菌蛋白,经过VDS凝胶扫描得到其分子量为28kDa,命名为AP28。抑菌活性分析表明,AP28对实验中涉及的大多数革兰氏阳性菌和阴性菌都有明显的抑制作用。