适配体结合蛋白质靶标的亲和力表征方法及其在疾病诊断中的应用

核酸适配体是通过体外指数富集配体系统进化（SELEX）技术筛选获得,并能够和蛋白质靶标高特异性、高亲和力结合的单链寡核苷酸。核酸适配体不但具有抗体的识别特性,而且具有自己独特的优良性能,目前已应用于分析检验、食品安全和生物医药等各个领域。蛋白质具有多种多样的生物功能以及临床诊断价值。因此,核酸适配体针对蛋白质靶标并在蛋白质相关的基础研究领域受到广泛的关注。核酸适配体应用性能的优劣取决于与其靶标蛋白质的亲和力与特异性。本文主要综述核酸适配体对蛋白质靶标的亲和力表征方法,以及在药物研发、肿瘤检测、生物成像以及生物传感器方面的应用。     

细胞特异性核酸适配体筛选新策略的研究进展

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合。近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键。本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考。     

核酸适配体在食品安全可视化检测中的应用研究进展

近年来,随着食品安全事件频发,研究者们愈加重视发展低成本、高灵敏、易操作的现场快速检测技术。核酸适配体因其高特异性、高亲和力、易于修饰和功能化等优点而被广泛地应用于生物医学和分析化学研究领域,特别是核酸适配体的可视化检测技术备受关注。基于核酸适配体的可视化检测方法具有选择性好、特异强、灵敏度高、无需大型贵重仪器等诸多优点,已成为一种极具应用潜力的检测方法。本手稿主要对核酸适配体技术以及核酸适配体在食源性致病菌、真菌毒素、农兽药残留、重金属等食品有害物质的可视化检测研究进展进行综述。     

基于表面等离子共振的适配体传感器应用研究进展

基于表面等离子共振的适配体传感器是利用适配体进行高特异性、高灵敏度、高通量检测的新型生物传感器。我们在简要阐述适配体的筛选方法、偶联技术及适配体传感器工作原理的基础上,结合最新的研究结果,对基于表面等离子共振的适配体传感器在生物活性小分子检测、传染病检测、肿瘤标志物检测、食品安全监测等方面的应用研究进展进行了综述。     

核酸适配体在病毒性疾病治疗中的研究进展

核酸适配体是一类通过指数级富集的配体进化技术(SELEX)获得的能以较高的亲和力与各类靶标特异性结合的小分子单链DNA或RNA。与抗体相比,核酸适配体具有合成简单、免疫原性低、体外容易修饰、价格低廉等优势,已在生物医学方面发挥了重要作用。病毒性疾病严重威胁人类健康,然而目前尚未有非常有效且毒副作用小的抗病毒药物。近年来核酸适配体在病毒性疾病治疗中的应用引起人们关注,已有越来越多的研究围绕核酸适配体作为抗病毒药物的应用而展开。核酸适配体可与病毒蛋白或核酸以高特异性及高亲和力结合,一些特异的核酸适配体可通过阻止病毒感染细胞的任一阶段如吸附、复制等达到抑制抗病毒作用,显示了较强大的抗病毒应用潜能。我们简要综述核酸适配体在病毒性疾病治疗方面的研究进展。     

综述与专论: 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性（抗核酸酶降解能力）的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术（捕获-SELEX,Capture-SELEX）和均相筛选技术（氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX）。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件（文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度）和所获得的适配体的亲和力（K_D,解离常数,dissociation constant）和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的K_D和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。     

适配体的筛选及在生命分析化学中的应用

指数级富集的配体系统进化技术（SELEX）是近年来发展的获得能够与靶分子高特异性和高亲力结合的寡核苷酸序列（适配体）的筛选技术。目前多种靶分子的适配体如蛋白或小分子,都已经通过SELEX技术筛选获得,使适配体在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及基因调控等领域已经成为重要的研究工具。本文就近几年适配体的筛选技术及在生命分析化学中的应用发展方面进行了综述。     

适配体传感器检测抗生素的研究进展

抗生素作为一种微生物的次级代谢产物,具有杀死或抑制微生物生长的作用。抗生素的滥用导致了它在食物中的残留量逐年增加。因此,需要建立一种快速灵敏检测方法用于食品中抗生素残留量的检测。核酸适配体传感器因其高选择性、高特异性和高灵敏性等优点而备受关注。同时,借助纳米材料独特的光、电特性,能够进一步提高适配体传感器的性能。本文综述了目前用于抗生素检测的核酸适配体传感器如荧光适配体传感器、比色适配体传感器和电化学适配体传感器等的研究进展。此外,还对该研究领域面临的挑战和未来前景进行了展望。     

细胞SELEX技术用于胰腺癌细胞特异性适配体的筛选及鉴定

细胞SELEX是目前常用的筛选细胞特异性适配体的技术。胰腺癌细胞特异性适配体在胰腺癌的诊断和治疗中有巨大的应用潜力。本研究拟通过该技术获得特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体,并对所筛选的适配体进行功能鉴定。本研究以胰腺癌PANC-1细胞为正筛细胞,正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7为负筛细胞,通过磁珠法细胞SELEX技术进行筛选。经过12轮筛选,对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序,获得2条适配体Apt-5和Apt-12。流式细胞术检测发现,适配体Apt-5和Apt-12可特异性识别PANC-1细胞,其Kd值分别为8.27±2.10 nmol/L和8.88±2.51 nmol/L,Kd值均处于纳摩尔级别。通过RNA结构预测,2条适配体的二级结构均为茎-环结构。细胞免疫荧光验证了适配体的结合部位为细胞膜表面。本研究表明,通过磁珠法细胞SELEX技术,成功获得可特异性识别胰腺癌PANC-1细胞的适配体。该适配体有望成为胰腺癌诊断和治疗中的特异性分子靶向剂。     

小分子靶标与其核酸适配体亲和力的表征方法

核酸适配体是指通过SELEX筛选得到的能与靶标高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA。目前国内外具有高亲和性和高特异性结合的小分子靶标的核酸适配体依然很少,究其原因,一方面是因为小分子靶标的适配体难以筛选,另一方面是小分子靶标与其候选适配体亲和力表征方法难以确定。亲和力表征是确定适配体筛选成功与否的关键步骤,就现有的小分子靶标与其相应适配体亲和力表征方法进行了总结,包括纳米金比色法、等温滴定量热法、表面等离子共振、圆二色谱法、石英晶体微天平法、微量热泳动法和SYBR Green I染料检测法等,并分析了这些方法的优缺点及改进建议,以期有助于提高适配体表征效率。     

SELEX技术在胰腺癌分子诊断及靶向治疗中应用的研究进展

胰腺癌由于起病隐匿,早期诊断率较低,临床治疗效果差,是目前预后最差的恶性肿瘤之一。目前,临床上尚缺乏有效的非创伤早期筛查胰腺癌的手段,因而胰腺癌的早期诊断和治疗显得尤为重要。近年来,指数富集配基的系统进化(SELEX)技术以其在其他疾病中所表现的应用价值为疾病的诊治提供了一个新的途径。对于缺乏有效确诊手段,发病隐匿且病死率高的胰腺癌而言,SELEX技术基于胰腺癌发病的分子机制,可以筛选出特异结合于胰腺癌分子靶标的适配体,对筛选所得适配体进一步化学修饰,可以实现分子水平成像及靶向治疗,进而达到胰腺癌早期诊治的目的,具有重要的临床意义。本文就SELEX技术在胰腺癌分子诊断及靶向治疗中的应用研究进展进行了综述。     

综述与专论: 核酸适配体在分子医学中的应用

分子医学着眼于从疾病的分子层面出发,为个性化精准诊疗提供解决方案。然而,在众多疾病的诊疗中由于缺乏有力的分子识别工具,目前从分子水平上理解和研究疾病仍受到制约。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化（SELEX）技术在体外筛选得到的单链寡核苷酸,具有高选择性、高亲和力、易细胞内化、良好的组织渗透和快速的组织积累能力。近年来,由于其易合成、成本低、稳定性高且免疫原性低,核酸适配体作为分子工具应用于疾病的诊疗一体化受到广泛关注。本综述围绕分子医学中的核酸适配体,讨论了核酸适配体在疾病诊断中的应用,包括基于核酸适配体的肿瘤标志物发现、液体活检、分子成像。介绍了核酸适配体在癌症治疗中的应用包括基于核酸适配体的抑制剂、核酸适配体药物偶联物、纳米药物和核酸适配体介导的免疫治疗。最后对核酸适配体在临床诊疗和产业化面临的问题进行了讨论,包括基于应用场景的筛选方法、核酸适配体与靶标复合物结构、亲和力的机制以及核酸适配体在血液循环中的稳定性等方面。     

Novel biotechnology approaches in colorectal cancer diagnosis and therapy

With ever-increasing molecular information about colorectal cancer (CRC), there is an expectation to detect more sensitive and specific molecular markers for new advanced diagnostic methods that can surpass the limitations of current screening tests. Moreover, enhanced molecular pathology knowledge about cancer has led to the development of targeted therapies, designed to interfere with specific aberrant biological pathways in cancer. Furthermore, biotechnology has opened a new window in CRC diagnosis and treatment by introducing different application of antibodies, antibody fragments, non-Ig scaffold proteins, and aptamers in targeted therapy and drug delivery. This review summarizes the molecular diagnostic and therapeutic approaches in CRC with a focus on genetic and epigenetic alterations, protein and metabolite markers as well as targeted therapy and drug delivery by Ig-scaffold proteins, non-Ig scaffold proteins, nanobodies, and aptamers.     

Advancing Aptamers as Molecular Probes for Cancer Theranostic Applications—The Role of Molecular Dynamics Simulation

Theranostics cover emerging technologies for cell biomarking for disease diagnosis and targeted introduction of drug ingredients to specific malignant sites. Theranostics development has become a significant biomedical research endeavor for effective diagnosis and treatment of diseases, especially cancer. An efficient biomarking and targeted delivery strategy for theranostic applications requires effective molecular coupling of binding ligands with high affinities to specific receptors on the cancer cell surface. Bioaffinity offers a unique mechanism to bind specific target and receptor molecules from a range of non‐targets. The binding efficacy depends on the specificity of the affinity ligand toward the target molecule even at low concentrations. Aptamers are fragments of genetic materials, peptides, or oligonucleotides which possess enhanced specificity in targeting desired cell surface receptor molecules. Aptamer–target binding results from several inter‐molecular interactions including hydrogen bond formation, aromatic stacking of flat moieties, hydrophobic interaction, electrostatic, and van der Waals interactions. Advancements in Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) assay has created the opportunity to artificially generate aptamers that specifically bind to desired cancer and tumor surface receptors with high affinities. This article discusses the potential application of molecular dynamics (MD) simulation to advance aptamer‐mediated receptor targeting in targeted cancer therapy. MD simulation offers real‐time analysis of the molecular drivers of the aptamer‐receptor binding and generate optimal receptor binding conditions for theranostic applications. The article also provides an overview of different cancer types with focus on receptor biomarking and targeted treatment approaches, conventional molecular probes, and aptamers that have been explored for cancer cells targeting.     

综述与专论: 核酸适配体在肾癌中的应用

肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一,发病率呈上升趋势。肾细胞癌作为肾脏肿瘤的主要类型,具有较高的局部浸润和远处转移的频率,约33%~50%的肾细胞癌患者在发现时已发生转移。由于肾细胞癌早期无特异性体征和症状,主要治疗手段是手术切除,对放化疗不敏感,治疗手段有限,因此肾细胞癌的早期诊断能够大大提高肾细胞癌有效治疗的机会,对于肾癌的有效治疗具有十分重要的意义。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）,从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,能够选择性地与小分子配体或高亲和力的蛋白质靶标结合,对靶分子或细胞具有较高的亲和力和特异性,目前已广泛应用于肿瘤影像学诊断及靶向治疗中。本文主要综述了与肾癌相关的核酸适配体,并对于适配体在肾癌诊疗中的应用进行了总结和讨论。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到 40条非癌核酸适配体序列和 41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的 4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为 90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。     

Selection of DNA Aptamers against Glioblastoma Cells with High Affinity and Specificity

Background

Glioblastoma is the most common and most lethal form of brain tumor in human. Unfortunately, there is still no effective therapy to this fatal disease and the median survival is generally less than one year from the time of diagnosis. Discovery of ligands that can bind specifically to this type of tumor cells will be of great significance to develop early molecular imaging, targeted delivery and guided surgery methods to battle this type of brain tumor.

Methodology/Principal Findings

We discovered two target-specific aptamers named GBM128 and GBM131 against cultured human glioblastoma cell line U118-MG after 30 rounds selection by a method called cell-based Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (cell-SELEX). These two aptamers have high affinity and specificity against target glioblastoma cells. They neither recognize normal astraglial cells, nor do they recognize other normal and cancer cell lines tested. Clinical tissues were also tested and the results showed that these two aptamers can bind to different clinical glioma tissues but not normal brain tissues. More importantly, binding affinity and selectivity of these two aptamers were retained in complicated biological environment.

Conclusion/Significance

The selected aptamers could be used to identify specific glioblastoma biomarkers. Methods of molecular imaging, targeted drug delivery, ligand guided surgery can be further developed based on these ligands for early detection, targeted therapy, and guided surgery of glioblastoma leading to effective treatment of glioblastoma.     

综述与专论: 肿瘤相关碳水化合物抗原的适配体研究

肿瘤细胞异常的糖基化模式是癌症的标志，在恶性转化和癌症进展中起着至关重要的作用。不同机制导致的肿瘤相关碳水化合物抗原（tumor-associated carbohydrate antigens，TACAs）不仅是临床肿瘤学诊断中公认的生物标志物，也为治疗干预提供了特定的靶点。适配体作为抗体或凝集素的有力替代品，近年来在碳水化合物的识别中展现了潜在的应用价值。本文聚焦于癌症中异常的糖基化改变，综述了目前TACAs识别适配体的开发进展。依据适配体筛选程序中的靶标来源，阐述了针对3种类型靶标，包括糖类分子、蛋白质聚糖表位，以及血清糖类抗原的筛选策略。从筛选方法、性能指标及相关应用性方面对适配体进行了总结，并讨论了当前研究中存在的问题和未来发展方向。     

SELEX技术在神经系统疾病研究中的应用

配体指数级富集系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术是一种组合化学技术,可经过反复筛选扩增得到针对靶分子的高亲和力和高特异性的适配子.适配子通过识别、结合特定靶分子并对其进行功能调控从而达到对疾病诊断和治疗的目的 .近年来SELEX技术在神经系统功能和疾病研究中的应用越来越多.现已经筛选出针对朊蛋白、肌腱蛋白-C、β-淀粉样肽、乙酰胆碱受体的自身抗体等靶标的适配子,促进了对朊病毒病、脑肿瘤、阿茨海默病、重症肌无力等神经系统疾病的诊断和治疗研究,为这些疾病的诊治提供了新的研究工具.