tPAcDNA在兔乳腺中的表达

组织型纤维原激活剂（tPA）的作用是激活血纤维蛋白酶原,从而溶解血栓。生物体内tPA的含量很低,远远不能满足临床需要。为了利用转基因动物生产tPA,需要对所用tPA乳腺表达载体pSVL－WAP－tPA2（Fig．1）进行予证。将三种特研究载体用脂质体包埋,注入中后期怀孕母兔乳腺。对乳汁、乳腺组织的mRNA和DNA分别进行检测。实验兔分娩后,每4天取乳汁冻存,ELISA检测其中tPA含量（Fig.2),泌乳期第4天最高可达600ng/ml。又,于乳腺注射第3天,手术切取部分乳腺组织,制备总RNA,以β－Casein启动子下游序列（TAC TAG…）为引物I,tPA上游序列（TTC CCA…）为引物II,做RT－PCR检测,表明：此时已有tPAmRNA转录（Fig.3)。再,于停乳后30天左右,切取部分乳腺制备DNA,以tPAcDNA为探针,做Southern杂交检测。表明：无tPA整合,仅是以附合体形式存在（Fig.4)。上述质粒直接注射技术是予证转基因用载体表达水平的快捷、简便方法。     

钙离子在颈动脉体化学感受性传递过程中的作用

在颈动脉体（ＣＢ）化学感受性传递过程中,球细胞释放递质的机制至今尚未阐明。有文献报道无Ｃａ２＋时化学感受器释放多巴胺和颈动脉窦神经电活动均减少。另有实验研究显示,在细胞外液无Ｃａ２＋时基础状态下和低氧诱导的球细胞内ｃＡＭＰ明显升高,腺苷酸环化酶激活剂...     

兔出血症病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

将RHDVVP60基因插入酵母转移载体pPICZB中转化毕赤酵母菌GS115株 ,经筛选获得染色体基因组中整合入VP60基因的重组酵母菌。以甲醇诱导培养后经SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物 ,在60kD处出现一特异蛋白条带 ,表明RHDV的衣壳蛋白得到了成功表达。血凝试验表明 ,表达的重组蛋白具有血凝特性 ,可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2.8,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组酵母表达的衣壳蛋白可以在酵母菌体内自聚成大小约4.0nm ,和天然RHDV病毒子在物理形态上类似的病毒样颗粒 (VLPs)。该病毒样颗粒与兔抗RHDV高免血清作用后可被凝集成团 ,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。     

脂肪酸脱氢酶基因在兔体内表达的生物学效应研究

目的研究脂肪酸脱氢酶基因在兔子体内的生物效应,探索不饱和脂肪酸与兔子免疫的相互作用。方法用壳聚糖(CS)和壳聚糖的聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)修饰产物(mPEG-O-CS-PEI),对含有脂肪酸脱氢酶基因的真核表达质粒VRMFat-1进行包裹,肌肉注射新西兰白兔,每两周采取抗凝血,检测血液中免疫细胞数量的变化情况,利用气相色谱仪检测动物组织中脂肪酸的含量变化,并通过荧光定量PCR检测免疫细胞内免疫相关基因的表达情况。结果两组实验兔组织中的n-3不饱和脂肪酸含量显著高于对照组(P<0.05),其TLR4、CD3、IL-4和IL-6基因表达水平显著升高(P<0.05)。结论转入的脂肪酸去饱和脱氢酶基因能够在实验兔体内正常表达,初步证明不饱和脂肪酸对兔子的固有免疫和获得性免疫机能均有明显的增强作用。     

小脑皮层在兔瞬膜条件反射过程中的调制作用

以音调结合气流刺激兔角膜的训练建立瞬膜条件反射,在条件反射率刚达90%,连续出现三组的学习初始阶段,电解损毁小脑半球第六小叶皮层使 D-I 核的学习相关性电活动和瞬膜条件反射消除,但不影响“非条件”反射,而在经一周巩固训练的动物,损毁小脑皮层上述区域不发生影响。D-I 核的细胞自发电活动在学习初期和记忆巩固时期也有所不同。在学习后期,D-I 核的细胞自发电活动频率减低,和在学习初期与损毁小脑皮层后的频率变化相似。实验结果表明:在瞬膜条件反射过程中,以小脑皮层为主导,对瞬膜条件反射的产生和D-I 核的学习相关性电活动具有调制作用。随着记忆巩固过程,D-I 核脱离皮层的控制而发展成为这一学习模式的记忆痕迹基础部位。     

异源Oct-4基因启动子在猪、兔和小鼠早期胚胎中的时空表达活性

Oct-4是一种哺乳动物早期胚胎中特异表达的转录因子,它与细胞多能性的维持有关．异源Oct-4基因在早期胚胎中的表达模式尚不明确．构建了一个以完整的牛Oct-4调控区指导GFP表达的转基因结构pOct-4(p)-GFP,通过单精子注射的方法将其导入猪、兔和小鼠的受精卵中,分析其在胚胎发育过程中的表达情况．结果显示：牛Oct-4启动子驱动的GFP基因在3个物种的2-细胞胚胎就已经开始表达,在囊胚期表达加强且只特异表达于内细胞团中,而不表达于滋养层．研究表明：牛的Oct-4启动子在其他物种中也具有表达活性,异源性Oct-4启动子在不同物种的早期胚胎中具有相似的表达模式．     

兔精子发生过程中cyclin B1基因表达和蛋白定位的发育阶段依赖性

利用原位杂交和免疫组化等方法,研究兔精子发生过程中生精细胞cyclin B1 mRNA的表达和蛋白定位特点,结果显示,兔生精上皮中Cyclin B1 mRNA的主要分布在初级精母细胞中,直至圆形精子细胞仍然存在,于精子细胞的变态过程中逐渐消失,在伸长的精子细胞和精子中未检测出cyclin B1 mRNA,Cyclin B1蛋白在进入分裂期的精原细胞和精母细胞中表达,在圆形精子细胞和伸长的精子细胞中呈现大量的cyclin B1蛋白,上述结果表明,在兔精子发生过程中,cyclin B1 mRNA表达和蛋白定位具有发育阶段依赖性的特征。     

高原鼠兔ob基因的组织表达特征

ob基因编码的leptin蛋白在调节生物体能量平衡中起到重要作用。本研究应用Taqman探针real time PCR技术对高原鼠兔ob基因的组织分布进行检测。通过提取不同组织总RNA,经DNase I消化后,用随机引物进行反转录合成cDNA,采用特异性Taqman探针和引物分别对ob基因及β-actin基因进行实时定量PCR扩增,对不同组织中ob基因和β-actin基因的初始拷贝数之比进行比较。结果表明ob基因在脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织中均有表达,其中以白色脂肪组织中ob基因表达量最高,其次为心脏和肺,表达量最低的是肝脏和肾脏。     

血管超声与64排螺旋CT血管造影在评价颈动脉狭窄中的对比研究

目的:比较血管超声与64排螺旋CT血管造影(CTA)对颈动脉狭窄的诊断价值。方法:选取2014年12月到2015年12月我院收治的疑似颈动脉狭窄患者70例(278节段),所有患者入院1周内均行血管超声、64排螺旋CTA检查,以数字减影血管造影(DSA)为金标准,比较血管超声与64排螺旋CTA对颈动脉狭窄诊断的符合率、特异度和灵敏度。结果:血管超声和64排螺旋CTA对不同程度颈动脉狭窄诊断的符合率比较,差异均无统计学意义(P0.05);血管超声和64排螺旋CTA对颈动脉狭窄诊断的灵敏度和特异度分别为87.28%、85.71%和85.55%、90.48%,比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:血管超声和64排螺旋CTA对颈动脉狭窄均具有较高的诊断价值。     

阿托伐他汀对颈动脉狭窄并支架置入术后患者临床预后及炎症因子的影响

目的：研究阿托伐他汀对颈动脉狭窄并支架置入术后患者临床预后及炎症因子的影响。方法：选取2013 年1 月到2014 年1 月我院收治的接受支架置入术的颈动脉狭窄患者90例,按照随机数字表法将患者分为研究组和对照组,每组45 例,对照组给予 常规治疗,研究组在对照组的基础上给予阿托伐他汀治疗,连续治疗1 年,比较两组支架内再狭窄率及不良反应发生率,分析治 疗前和治疗后两组超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-6（IL-6）水平。结果：研究组1 年内支架再狭窄率显著低于对照组,两 组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）;治疗后两组hs-CRP 和IL-6 水平均显著低于治疗前,且研究组显著低于对照组,比较差异 具有统计学意义（P＜0.05）;两组不良反应比较无统计学意义（P＞0.05）。结论：阿托伐他汀治疗颈动脉狭窄并支架置入术患者,能 显著降低支架内再狭窄率及炎症因子水平。     

颈内动脉支架置入术对颈动脉狭窄患者认知功能影响的研究

目的：研究颈动脉狭窄对认知功能的影响,探讨颈动脉支架置入术（CAS）患者术后不同时期认知功能的变化及其可能的机制。方法：选取2010年1月至2012年12月我院神经内科收住的急性脑梗死（前循环）患者75例,按颈内动脉狭窄程度,分成无狭窄组,轻度狭窄组（狭窄程度〈30％）,中度狭窄组（30-69％）和治疗组（70．99％）,前三组给予药物治疗,治疗组同时给予颈内动脉支架置入术,应用蒙特利尔认知评估量表（MoCA）、简易精神状态检查表（MMSE）、搭火柴测验（stickTest）,对患者进行认知功能评估,比较术前、术后不同时期认知功能的变化,同时利用SPECT／CT对治疗组20例患者术后局部脑血流改善状况进行评价。结果：治疗组和对照组在术前比较MoCA总分、MMSE评分、StickTest评分,发现治疗组评分低于对照组,且随着颈动脉狭窄程度的加重,认知功能受损越明显;治疗组在术后1周与术前比较,评分反而降低,差异有统计学意义;术后3个月、术后6个月与术前比较,评分均有所提高,差异有统计学意义;通过SPECT／CT对治疗组术前感兴趣区血流量与同侧小脑平均脑血流量比较,术后再与同侧小脑比较,结果显示术后脑灌注明显改善。结论：颈动脉狭窄与血管性认知功能障碍有关,而且认知功能障碍的程度与颈动脉狭窄程度呈正相关,颈内动脉支架置入术可最终改善认知功能,尤其表现在视空间／执行能力,延迟回忆能力,注意力等方面。     

IL-10 Accelerates Re-Endothelialization and Inhibits Post-Injury Intimal Hyperplasia following Carotid Artery Denudation

The role of inflammation on atherosclerosis and restenosis is well established. Restenosis is thought to be a complex response to injury, which includes early thrombus formation, acute inflammation and neo-intimal growth. Inflammatory cells are likely contributors in the host response to vascular injury, via cytokines and chemokines secretion, including TNF-alpha (TNF). We have previously shown that IL-10 inhibits TNF and other inflammatory mediators produced in response to cardiovascular injuries. The specific effect of IL-10 on endothelial cell (ECs) biology is not well elucidated. Here we report that in a mouse model of carotid denudation, IL-10 knock-out mice (IL-10KO) displayed significantly delayed Re-endothelialization and enhanced neo-intimal growth compared to their WT counterparts. Exogenous recombinant IL-10 treatment dramatically blunted the neo-intimal thickening while significantly accelerating the recovery of the injured endothelium in WT mice. In vitro, IL-10 inhibited negative effects of TNF on ECs proliferation, ECs cell cycle, ECs-monocyte adhesion and ECs apoptosis. Furthermore, IL-10 treatment attenuated TNF-induced smooth muscle cells proliferation. Our data suggest that IL-10 differentially regulate endothelial and vascular smooth cells proliferation and function and thus inhibits neo-intimal hyperplasia. Thus, these results may provide insights necessary to develop new therapeutic strategies to limit vascular restenosis during percutaneous coronary intervention (PCI) in the clinics.     

凝血酶调节蛋白基因防治血管内膜增生狭窄的实验研究

目的:观察凝血酶调节蛋白(Thrombomodulin,TM)基因转染兔髂动脉损伤模型后,对动脉血管内膜增生狭窄的防治作用。方法:用注射式加压转染的方式对兔动脉壁转染pcDNA3.1/hTM质粒,再制造动脉损伤-阻滞模型,于术后3天、7天、14天、28天用免疫组化的方法观察TM蛋白在各组血管腔内的表达,术后14天、28天用彩色多普勒观察活体吻合口内径和血流流速;再做病理切片Verhoeff染色,观察血管内膜增生的程度、部位,计算血管内膜面积、中膜面积和血管狭窄率。结果:术后3天、7天、14天、28天hTM质粒转染组中hTM表达一直保持在高水平,7天达到高峰,14天、28天虽有所下降但是表达强度仍然高于载体质粒转染组合空白对照组。在术后14天、28天彩色多普勒观察测量吻合口内径:hTM质粒转染组分别为1.93mm±0.34mm,1.89mm±0.28mm;载体质粒转染组为1.59mm±0.43mm,1.38mm±0.28mm;空白对照组1.46mm±0.25mm,1.44mm±0.32mm。在这两个时间点,hTM质粒转染组血管狭窄率为32±23%,37±14%;载体质粒转染组为58±21%,63±17%;空白对照组为58±19%,61±23%。结论:hTM基因在转染动脉壁后能减少动脉损伤-阻滞模型在后期的血管内膜增生,改善血管的狭窄状况。     

AT2R载体可调控表达对大鼠颈动脉损伤后骨桥蛋白及新生内膜增生的影响

目的:血管紧张素Ⅱ 2型受体(AT2R)基因转染的骨髓间充质干细胞(MSC)在四环素可调控系统下作为载体,利用计算机图像分析系统研究新生内膜增生的情况,并探讨AT2R在体可调控表达对大鼠颈动脉损伤后骨桥蛋白(OPN)表达影响。方法:利用球囊损伤60只SD大鼠颈动脉,并随机将SD大鼠分为5组,分别为正常组(未行球囊扩张术)、对照组(球囊扩张术后注入PBS)、MSC组(球囊扩张术后注入常规MSC)、MSC转染组(球囊扩张术注入转染AT2R的MSC)、强力霉素(Dox)组(球囊扩张术后注入转染AT2R的MSC,术后当天至处死前三天通过尾静脉注射Dox 100μg/kg/d)。术后14及28天分别处死大鼠取材,光镜下观察血管内膜增生情况,Image pro plus 6.0计算机图像分析系统测量新生内膜面积(I/M),逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测AT2R及OPN在大鼠血管标本中的表达变化。结果:大鼠颈动脉AT2R在Dox组的表达显著增高,新的增生内膜面积较其它各损伤组显著降低(P≤0.01),并且OPN的表达显著低于其他各手术组。结论:AT2R基因在体可调控表达受到Dox的有效控制,AT2R基因可能抑制血管损伤后OPN的表达及新生内膜的过度增生。     

Interference of IP-10 Expression Inhibits Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Intimal Hyperplasia in Carotid Artery: A New Insight in the Prevention of Restenosis

After vascular angioplasty, vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation causes atherosclerosis and intimal hyperplasia leading to restenosis. Interferon-γ-inducible protein (IP)-10 plays a role in atherogenesis, but the mechanism remains unclear. We evaluated the role of IP-10 in intimal hyperplasia and restenosis. IP-10 expression was determined in arterial specimens from 20 arteriosclerotic obliteration patients and 6 healthy individuals. VSMCs were stimulated in vitro with IFN-γ and transfected with IP-10 siRNA. Silencing was verified with RT-PCR/Western blot; cell proliferation rate was detected by methyl-thiazol-tetrazolium. The carotid artery model of atherosclerosis injury was established with IP-10 siRNA. IP-10 expression was detected at 1 and 4 weeks using RT-PCR and immunohistochemistry. Artery morphology was assessed with hematoxylin-and-eosin staining, and intimal hyperplasia was evaluated by electron microscopy. IP-10 was overexpressed in arteriosclerotic obliteration group compared with control group (P < 0.05). IP-10 expression in transfected group was significantly lower than in untransfected group. The intima-to-media ratio of transfected group at 4 weeks was lower than that of untransfected group (P < 0.01). The transfected group exhibited more regular intimal structure and less hyperplasia under electron microscopy. We, therefore, concluded that IP-10 played an important role in intimal hyperplasia as siRNA-mediated IP-10 silencing inhibited aberrant VSMCs hyperplasia and reduced restenosis.     

颈动脉支架置入术改善认知功能

目的:观察颈动脉狭窄患者支架置入术时其认知功能的影响及简易精神评估量表(MMSE)与蒙特利尔认知评估北京版(MoCA)有无相关性。方法:收集124例颈动脉支架置入患者,在支架置入前及置入后1、3、6月分别应用简易精神评估量表(MMSE)、蒙特利尔认知评估北京版(MoCA)、P300检测患者认知功能的变化,同时对患者卒中有无复发进行登记,所有患者意识清楚,能配合完成上述检查。结果:所有患者安全、成功的置入颈动脉支架,无相关并发症出现;支架置入前颈动脉的狭窄率为(84±8.6)%,支架置入以后颈动脉狭窄率为(4.8±3.8)%,狭窄率较术前明显狭窄:支架置入前患者的MMSE、MoCA及P300潜伏期分别为21±3.1、14±3.6 ms,在治疗后随访的1、3及6个月,MMSE、MoCA明显提高而P300明显缩短;MMSE与MocA呈正相关;在随访期内患者无有症状的卒中复发。结论:颈动脉狭窄是导致认知功能障碍的原因之一,颈动脉支架置入可以改善患者认知功能障碍。     

Expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and RECK during alveolar bone regeneration in rat

MMPs are endopeptidases that play a pivotal role in ECM turnover. RECK is a single membrane-anchored MMP-regulator. Here, we evaluated the temporal and spatial expression of MMP-2, MMP-9, and RECK during alveolar bone regeneration. The maxillary central incisor of Wistar rats was extracted and the animals were killed at 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, and 42 days post-operatively (n = 3/period). The hemimaxillae were collected, demineralized and embedded in paraffin. Immunohistochemical analysis was performed by the immunoperoxidase technique with polyclonal antibodies. On day 1, polymorphonuclear cells in the blood clot presented mild immunolabeling for MMPs. During bone remodeling, osteoblasts facing new bone showed positive staining for gelatinases and RECK in all experimental periods. MMPs were also found in the connective tissue and endothelial cells. Our results show for the first time that inactive and/or active forms of MMP-2, MMP-9 and RECK are differentially expressed by osteogenic and connective cells during several events of alveolar bone regeneration. This may be important for the replacement of the blood clot by connective tissue, and in the formation, maturation and remodeling of new bone.     

RECK及MMP-9蛋白在皮肤鳞状细胞癌中的表达及临床病理意义（英文）

目的：观察RECK基因及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在皮肤鳞状细胞癌（CSCC）中的表达,探讨其与肿瘤浸润转移的关系。方法：应用免疫组化SP法检测40例CSCC组织、17例癌旁不典型增生组织及14例正常皮肤组织中RECK及MMP-9蛋白的表达。结果：①RECK在CSCC、癌旁不典型增生及正常皮肤中的表达率依次增高（30.0%、47.1%、85.7%）,组间比较差异有统计学意义（P＆lt;0.05）;MMP-9蛋白在CSCC、癌旁不典型增生及正常皮肤中的表达率依次降低（82.5%、76.4%、28.6%）,组间比较差异有统计学意义（P＆lt;0.05）②RECK及MMP-9与CSCC的组织学分级、淋巴结转移密切相关（P均＆lt;0.05）;与CSCC患者的性别、年龄无关（P均＆gt;0.05）③RECK及MMP-9在CSCC中的表达呈负相关（r=-0.475p＆lt;0.01）。结论：RECK和MMP-9与CSCC的浸润转移密切相关,RECK在CSCC中表达减少或缺失可能是通过上调MMP-9的表达从而促进CSCC的侵袭与转移。     

17-AAG对大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响及其作用机制

目的:研究17-丙烯胺-17去甲氧格尔德霉素(17-Allylamino-17-emethoxy-geldanamycin, 17-AAG)对球囊损伤后大鼠颈总动脉内膜增生的影响及可能作用机制。方法:将清洁级雄性SD大鼠36只按照随机数字法分为假手术组(Sham组)12只、球囊损伤组(Balloon injury, BI组)12只及17-AAG治疗组(17-AAG组)12只。采用2F Fogarty球囊建立大鼠颈总动脉球囊损伤组模型,17-AAG治疗组大鼠在建模后腹腔注射17-AGG(20 mg/kg 2d)。各组大鼠于球囊损伤3周后取损伤段颈总动脉,通过HE染色观察血管内膜形态学改变并评估内膜增生情况,免疫组化染色(Immunohistochemical staining,IHS)法检测血管壁增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达,评估血管平滑肌细胞的增殖情况。流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。结果:BI组、17-AAG组大鼠球囊损伤后颈总动脉内膜出现不同程度增生,内膜/中膜面积比(Intima area/Membrane area,I/M)均较Sham组显著升高(P0.05);17-AAG组的I/M较BI组明显下降(P0.05)。BI组、17-AAG组颈总动脉PCNA表达水平较Sham组明显升高(P0.05),较BI组显著降低(P0.05)。BI组、17-AAG组大鼠血管平滑肌细胞凋亡率较Sham组显著升高(P0.05);17-AAG组大鼠血管平滑肌细胞凋亡程度较BI组明显升高(P0.05)。结论:17-AAG对球囊损伤后颈总动脉内膜增生存在抑制作用,其机制可能是通过提高血管平滑肌细胞凋亡率影响其增殖程度。     

Regulation of Tyrosine Hydroxylase Gene Expression in the Rat Carotid Body by Hypoxia

The activity (Vmax) of tyrosine hydroxylase (TH; EC 1.14.16.2), the rate limiting enzyme in the synthesis of catecholamines, is increased in carotid body, superior cervical ganglion, and the adrenal medulla during hypoxia (i.e., reduced PaO2). The present study was undertaken to determine if the increase in TH activity in these tissues during hypoxia is regulated at the level of TH mRNA. Adult rats were exposed to hypoxia (10% O2) or room air for periods lasting from 1 to 48 h. The carotid bodies, superior cervical ganglia, and adrenals were removed and processed for in situ hybridization using 35S-labeled oligonucleotide probes. The concentration of TH mRNA was increased by hypoxia at all time points in carotid body type I cells, but not in cells of either superior cervical ganglion or adrenal medulla. The increase in TH mRNA in carotid body during hypoxia did not require innervation of the carotid body or intact adrenal glands. In addition, hypercapnia, another physiological stimulus of carotid body activity, failed to induce an increase in TH mRNA in type I cells. Our findings suggest that hypoxia stimulates TH gene expression in the carotid body by a mechanism that is intrinsic to type I cells.