地衣芽孢杆菌YP1A耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达

根据B．licheniformis YP1A来源的碱性蛋白酶具有的高强度耐有机溶剂性能及相关数据库分析,采用PCR克隆B．licheniformis YP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因,序列分析显示该基因（1264bp）包含启动子与编码380个氨基酸的开放阅读框（ORF）,ORF包括信号肽、前肽及编码254个氨基酸的成熟肽序列。相关基因分析表明,YP1A耐有机溶剂碱性蛋白酶基因与地衣芽孢杆菌ATCC14580的碱性蛋白酶基因仅有6个氨基酸残基差异：构建2种含YP1A碱性蛋白酶CDS的组成型穿梭表达载体pHY／aprYP与pHY／aprP43,前者采用YP1A蛋白酶自带的启动子,后者则采用来自于质粒pP43NMK的P43强启动子。利用这2种表达载体在枯草芽孢杆菌WB800中成功进行蛋白酶的功能表达．其中P43强启动子的表达能力明显优于碱性蛋白酶自带的启动子,表达的蛋白酶比酶活为395U／ml。重组菌表达的碱性蛋白酶在体积分数50％的亲水及疏水有机溶剂中表现出了很好的耐受性,验证了克隆基因为地衣芽孢杆菌YP1A的高强度耐有机溶剂碱性蛋白酶基因.     

枯草杆菌碱性蛋白酶水解玉米皮蛋白

以枯草杆菌碱性蛋白酶对玉米皮进行水解,制取玉米蛋白水解液,结果,该酶水解的最佳工艺条件为：在浓度5％的玉米皮中加2．67％酶制剂,pH7.5,55度反应1h,制得的蛋白水解液中,蛋白质溶出率为89．3％,水解度为9．0％。     

响应面法优化黄绿蜜环菌子实体蛋白酶解条件

黄绿蜜环菌（Armillaria luteo—virens Sacc）子实体中蛋白含量很高,采用酶水解黄绿蜜环菌子实体蛋白的方法是生产具有生物学功能特性的活性肽的有效途径。实验采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解黄绿蜜环菌子实体蛋白制备生物活性肽。实验中确定了酶解前处理条件,即最适宜的酶制剂为中性蛋白酶。酶解条件的优化采用中心组合响应面分析法：建立数学模型回归分析,模型评价,最后进行验证实验。结果表明：底物浓度为7．6％、加酶量为1．6％、酶解温度为52％、酶解时间为6．4h,此条件下蛋白水解度最高。     

枯草杆菌碱性蛋白酶基因诱导表达载体的构建

以PCR方法扩增sacB基因的启动子-信号肽序列(称为sacR),将其与枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的前肽-成熟酶基因连接后克隆入载体pUBH,构建了含碱性蛋白酶基因的分泌型诱导表达载体pUBS,将其转化枯草芽孢杆菌DB403后,获得基因工程菌DB403(pUBS)。碱性蛋白酶基因在sacR的调控和蔗糖的诱导下实现了表达分泌,获得了具生物学活性的碱性蛋白酶。     

桑枝总黄酮的提取工艺研究

研究桑枝总黄酮的最佳提取工艺,本试验以桑枝（Tang10）为材料,以桑枝总黄酮得率为考察目标,采用二次回归正交旋转组合设计方法研究了提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比对桑枝总黄酮提取得率的影响,运用DPS软件对最佳工艺进行优化和验证。结果显示：试验范围内各因子对桑枝总黄酮提取率作用影响大小依次为提取温度〉料液比〉乙醇浓度〉提取时间;最佳提取参数为温度80℃,提取时间3．5h,乙醇浓度60％,料液比1：40部。因此,所建立数学回归模型在试验范围内能较准确的预测桑枝总黄酮的提取率．预测值与实测值相吻合,证明最佳工艺条件切实可行。     

粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因大肠杆菌优化表达

以粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板扩增得到磷脂酶A1基因plaA和含有辅助蛋白的磷脂酶A1基因plaB.plaA和plaB基因与pET-28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达,得到基因工程菌AP28和BP28.AP28最佳的诱导表达条件为诱导初始OD600值0.5,IPTG浓度为0.2mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为4h,优化后磷脂酶A1蛋白表达水平从32％上升至46％,包涵体复性的磷脂酶A1酶活从10.8U/ml上升到12U/ml,相对于BP28工程菌,目的蛋白的表达对宿主细胞毒性小,而且得到的蛋白容易纯化.因此通过优化磷脂酶A1基因plaA的诱导条件,使磷脂酶A1以大量的包涵体形式表达,从而得到较高活性的磷脂酶A1并避免其对宿主细胞的毒性是可行的,而且可以得到大量纯化的磷脂酶A1蛋白,方便下一步的研究.     

海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶

以海藻酸钠为载体,包埋法固定菠萝蛋白酶,对固定化奈件进行优化,同时探讨固定化菠萝蛋白酶的部分酶学性能。结果表明：固定化菠萝蛋白酶的质量受海藻酸钠质量分数、固定化酶量、固定化时间以及CaCl2质量分数的影响,其最佳固定化条件为：海藻酸钠质量分数1．0％,CaCl2质量分数3％,固定化酶液量与海藻酸钠体积之比1：2,固定化时间60min,在此条件下,制备的固定化菠萝蛋白酶的比活力为211．8U／g（湿质量载体）,由此制得的固定化酶的最适pH为7．6,与游离酶相比,升高了0．8个pH单位,同时显示固定化菠萝蛋白酶能耐受较高的碱性环境,固定化酶最适温度与游离酶相同,均为50℃,固定化酶在较高温度范围内,仍能保持较高的相对活力。     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

一新富含甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的优化表达

目的：探索大肠杆菌原核表达系统制备具有生物功能的抗菌肽的最佳诱导条件。方法：将富甘氨酸果蝇抗菌肽基因的核心片段构建表达载体pET32a＋中,经序列分析证实基因序列的正确性。在不同温度、不同时间和不同IPTG浓度进行诱导后,用15％SDS—PAGE检测融合蛋白的表达,发现有一条分子量约8kD的新增蛋白条带。结果：研究表明在37℃菌液OD值0．8时诱导7h蛋白表达量最高（IPTG0．7mmol/L,AMP100μg/ml,0．3％Glu）。结论：获得了抗菌肽表达的最佳诱导条件,为大量诱导产生该抗菌肽奠定了理论基础。     

响应面法优化海洋微生物发酵产生纤溶化合物的培养条件

采用响应面法对海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216发酵产生纤溶化合物FGFC1 (Fungi fibrinolyticcompound 1)培养条件进行优化.在单因素试验结果的基础上通过Design-Expert软件对培养时间、诱导物添加量、培养温度进行3因素响应面试验设计,以FGFC1产出量为响应值优化菌株FG216的培养条件,并验证响应面预测值与实测值的一致性.结果表明,在培养时间为9d、诱导物添加量为0.5％、培养温度为28℃的最优培养条件下FGFC1产量可达1 978.33 mg/L,实测值与响应面预测值拟合良好,说明通过响应面试验设计对FG216培养条件的优化是有效的.     

地衣芽孢杆菌D-1产碱性蛋白酶培养条件的优化

为了对产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌D-1的培养条件进行优化,利用10 L发酵罐,采用正交设计19(34)试验,对培养温度、pH值、搅拌转速、通气量4条件进行优化,得到地衣芽孢杆菌D-1发酵产碱性蛋白酶的最优培养条件为:培养温度37.0℃,pH值7.5,通气量4L/min,搅拌转速300r/min.利用最优条件组合进行验证...     

转Btc-ry1 Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响

研究了取食转Bt-cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫Propylaea japonica（Thunberg）体内解毒酶和中肠蛋白酶活性的影响。利用饲喂结合比色方法,比较龟纹瓢虫取食转Bt-cry1Ah基因玉米花粉和非转基因玉米花粉后体内α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的酶活性。结果发现：在解毒酶方面,取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫4龄幼虫和蛹的α-乙酸萘酯酶活性显著低于取食非Bt玉米花粉的龟纹瓢虫（对照组）,取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性在各个发育时期与对照相比均无显著差异。在中肠蛋白酶方面,与对照组相比,取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的总蛋白酶和强碱性类胰蛋白酶活性在各个发育时期均无显著差异;但取食Bt玉米花粉的龟纹瓢虫的弱碱性类胰凝蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性在蛹期显著低于取食非Bt玉米花粉的龟纹瓢虫。由此可见,龟纹瓢虫取食含有Cry1Ah杀虫蛋白的玉米花粉后,体内代谢解毒酶和中肠蛋白酶与Cry1Ah杀虫蛋白相互作用,可能会引起某些酶活性的变化。因此,转cry1Ah基因玉米花粉对龟纹瓢虫的潜在影响还需要进一步的研究。     

甲醇／山梨醇共混诱导改善重组毕赤酵母表达猪a干扰素发酵过程和NADH再生效率

在10L发酵罐中利用重组毕赤酵母诱导表达猪a干扰素（pIFN-a）,考察甲醇／山梨醇共混诱导策略对pIFN-a表达水平提高和能量（NADH）再生效率的影响。结果表明：在诱导稳定期,甲醇／山梨醇共混诱导可弱化细胞的甲醇代谢,有利于缓解毒副中间产物（过氧化氢、甲醛等）的生成积累;以0．785g／（L·h）的速率缓慢共混流加山梨醇时,pIFN-a抗病毒活性最大,最高活性可达1．8×107IU／mL,与30℃常温甲醇单独诱导（最高活性1．0X10。IU／mL）和20℃低温甲醇单独诱导（最高活性1．4×lO6IU／mL）相比,活性均大幅提高,且胞外pIFN-a的降解减缓;发酵体系的抗高甲醇浓度冲击能力有效提高,发酵生产的稳定性增强;能量利用效率大幅提高,NADH的再生利用效率提高了29％-84％。     

丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶瞬时表达小鼠模型的建立

目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶体内活性评价模型。方法:利用NS4A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性,构建融合基因NS3/NS4A/B-SEAP,底物片段NS4A/B插在NS3/4A和人分泌性碱性磷酸酶(SEAP)之间,融合基因表达后SEAP的分泌依赖于有活性的NS3/4A在NS4A/B位点的切割。将含融合基因的质粒NS3/4A(△4AB)SEAP通过水动力转染技术转染到小鼠体内,检测小鼠血清中SEAP的活性,高活性的SEAP是该评价体系成立的证据。结果与结论:在瞬时表达NS3/4A的小鼠血清中检测到了高活性的SEAP,建立了可用于评价抗NS3/4A的小鼠体内瞬时模型。     

人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b（＋）,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL2l（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性。重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b（＋）。IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达。优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性。重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用（酪蛋白为底物）,重量抑制比为1∶3.1,抑制比活性为2511U/mg。     

一株产低温碱性脂肪酶菌株的发酵条件优化

对一株产低温碱性脂肪酶细菌（Pseudoalteromonas sp．BJ17）的发酵条件进行了优化,研究各种碳源及氮源对产酶的影响,应用正交实验优化其发酵培养基组成。结果表明：最佳培养基组成为淀粉12g／L,蛋白胨12g／L,酵母膏3g／L,酪蛋白2g/L。最佳培养温度为25℃,发酵时间为16h。     

内切中性纤维素酶EGⅡ的发酵条件优化

对毕赤酵母基因工程菌EIM-50-eg2产内切中性纤维素酶的主要影响因子进行研究,考察氮源、pH、温度、微量元素PTM1和甲醇浓度等对工程菌产酶的影响。单因素实验和正交实验结果表明,优化后的培养基组成及培养条件:磷酸氢二铵40 g/L,甲醇15 mL/L,硫酸镁10 g/L,磷酸二氢钾9 g/L,初始pH 6.0,培养温度28℃,PTM1添加量0.02%,甲醇诱导浓度1.5%。优化后内切葡聚糖酶活力可达4 158 U/(mL.min)是优化前1 449 U/(mL.min)的2.86倍。     

极地适冷菌Pseudoalteromonas sp. QI-1产适冷蛋白酶发酵条件的优化

对极地适冷菌Pseudoalteromonas sp. QI-1产适冷蛋白酶的发酵条件进行优化。结果表明:菌株QI-1的最适生长和产酶温度均为5℃;最佳接种量为1%;发酵培养基的最适初始pH和最佳装样量分别为5和10%;盐度为2%时对菌株的生长和产酶最为有利;麸皮和醋酸钠分别为最佳N源和C源;添加0.75%酪蛋白时菌株QI-1胞外蛋白酶的活性最高;10 mmol/L Mg2+和0.5%Tween-80有利于产酶。正交试验结果表明:菌株Pseudoalteromonassp. QI-1产蛋白酶较佳培养基配方(g/L)为麸皮5,酵母粉2.5,酪蛋白3,MgCl2.6H2O 3,KCl 1.5;发酵液比酶活为166.20 U/mL,较优化前提高了约56%。     

碱性蛋白酶高产菌株EIM-8的筛选鉴定及其液体发酵条件优化

筛选分离得到一株高产碱性蛋白酶菌株EIM-8,并基于16S序列进行分子系统进化分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).同时,采用响应面法对Bacillus subtilis EIM-8的产酶条件进行了优化.首先通过单因素试验,筛选出最适碳源为玉米淀粉,最适氮源为牛肉膏.在此基础上,采用Pl...     

产碱性蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

通过测量比较在碱性蛋白平板上产生的蛋白水解圈直径,从土壤中筛选到一株高产蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079,根据生理生化特性、16S rDNA序列,鉴定为B.amyloliquefaciens。其最适培养温度为35°C-37°C,最适生长pH 8.0,在特定培养条件下16 h达到稳定期,菌体生长和蛋白酶合成同步进行。以大豆分离蛋白为氮源时发酵液具有最高酶活。发酵液在pH 10时具有最高酶活,表明为碱性蛋白酶。该菌株产生的碱性蛋白酶可水解多种天然蛋白质,对胶原蛋白水解度高于其他蛋白质,对羽毛角蛋白也有一定水解能力,提示该酶具有一定新颖性。