实验3 RNA的分离纯化

一、哺乳类细胞总RNA的提取 1.从培养细胞中提取 (1)准备10瓶(底面积为4.5×8.5cm~2)长得半满的培养细胞(约10~7个细胞)。 (2)吸去瓶中培养液,各加入5ml新鲜培养液,37℃培养4小时左右。 (3)吸去培养液,各加入5ml预冷的1×PBS溶液     

树突状细胞受曲霉菌抗原冲击后的变化

目的探讨树突状细胞(DCs)在曲霉菌免疫中的作用以及曲霉菌抗原冲击对DCs功能的影响。方法小鼠骨髓制备DCs,于小鼠尾静脉接种,以3H-TdR掺入法检测DCs刺激小鼠脾脏T细胞分化能力,ELISA方法检测IFN-γ和IL-12的浓度,电镜观察DCs的形态,同时进行DCs的表型测定。结果电镜下可见DCs细胞形态不规则,表面伸展出大量树突,与曲霉菌共同培养后胞内含有大量的烟曲霉孢子,部分孢子的膜被破坏;与烟曲霉孢子共培养24h后,DCs细胞表形CD40、CD80、CD86的表达明显增高,产生IL-12p70约(700.40±93.75)pg/ml,明显高于对照组(141.96±52.06)pg/ml;烟曲霉抗原冲击DCs回输小鼠的脾脏T细胞增殖能力明显增强,体外接受烟曲霉抗原24h产生IFN-γ(1084.33±238.04)pg/ml,明显高于单纯DCs接种小鼠的脾脏T细胞(345.98±32.75)pg/ml(p<0.01)。结论DCs能吞噬并破坏加热灭活的烟曲霉孢子,并趋于成熟,抗原呈递能力增加。     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。     

雷公藤单体T10对Aβ1-42所致PC12细胞凋亡的抑制作用

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是发病率最高的中枢神经系统退变性疾病.目前AD的病因不清,亦无有效的防治手段,其重要的原因是尚无适宜的AD模型.因此,本实验首先建立了PC12细胞系β淀粉样蛋白(p-amyloid,Aβ)细胞损伤模型,在此基础上,探讨了中药免疫抑制剂雷公藤单体T10对细胞的保护作用及其机制.首先用不同浓度的Aβ(5×10、5×10-3、5×10-2、5×10、5、50 μmol/L)与PC12细胞共孵育48 h,用MTT法检测细胞存活率.选取Aβ致使细胞存活率降低的浓度(0.5、5、50 μmol/L)与PC12细胞共孵育48 h,通过流式细胞仪检测凋亡细胞百分比.用1×10-11mol/L的T10预孵育PC12细胞48 h后,加入50μmol/L Ap共孵育48 h,亦用流式细胞仪检测凋亡细胞百分比,激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度变化.结果显示,Aβ的浓度存50μmol/L时可使细胞存活率降低至55.1%,凋亡细胞比例显著增加,而1×10-11mol/L的T10可明显降低50 μmol/L Aβ诱导的PC12细胞死亡.50 μmol/L Aβ可促进PC12细胞胞外钙离子内流,1×10-11mol/L的T10对Ap诱导的胞外钙离子内流有抑制作用.这些观察结果表明T10对Ap导致的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制Aβ诱导的胞内钙离子浓度升高和细胞凋亡有关.     

减毒HAV在体外抑制HBV表达HBeAg和HBsAg的实验研究

目的　探索减毒甲型肝炎病毒( HAV) ( H2减毒株)在Hep G2 .2 .15细胞中对乙型肝炎病毒( HBV)表达HBs Ag和HBe Ag的影响。方法　在Hep G2 .2 .15细胞中,加入含3×10 - 2 ( 3×10 4 .5CCID50 / ml) ,3×10 - 3( 3×10 3.5CCID50 / ml)浓度的减毒HAV。按不同疫苗浓度,每4 d换液1次,留取第12和第16天的培养上清液;同时设立对照组。用微粒子酶免分析法检测培养上清液中的HBs Ag和HBe Ag含量。计算减毒HAV在不同浓度,以及不同作用时间长度的条件下,对Hep G2 .2 .15细胞表达HBs Ag和HBe Ag的影响。结果　3×10 - 2 Ampoule/ ml的减毒HAV作用Hep G2 .2 .5细胞12 d后,培养上清液的HBe Ag浓度为( 4 7.2 3±6 .18) S/ CO,低于对照组的( 10 1.15±15 .77) S/ CO,2组比较差异有非常显著性( P<0 .0 1) ;16 d后,上清液HBe Ag含量为( 4 0 .2 7±13.30 ) S/ CO,也显著低于对照组的( 6 5 .85±3.4 6 ) S/ CO( P<0 .0 5 ) ;HBs Ag含量为( 2 .6 8±0 .31) S/ N,低于对照组的( 5 .10±1.2 7)S/ N,差异有显著性( P<0 .0 5 )。而3×10 - 3Ampoule/ ml的减毒HAV作用Hep G2 .2 .15细胞12 d后,培养上清液的HBs Ag浓度与对照组比较有显著性下降( P<0 .0 5 )。结论　一定浓度的减毒HAV可能有直接抑制HBV表达HBs Ag,HBe Ag的作用     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.     

两种昆虫细胞的微载体培养

斜纹夜蛾细胞系(SL-1)和家蚕细胞系(BmN)均能在国产微载体上正常生长增殖。以3mg/ml微载体培养细胞,两种昆虫细胞生长最高密度分别为8.2×10~5细胞/ml和7.6×10~5细胞/ml。扫描电镜观察显示一个微载体可贴附几十个,有的多达上百个细胞。两性昆虫细胞的微载体培养特征与常规静止培养无甚差异。     

用微载体悬浮培养系统增殖细胞和病毒

我们用我院制备的MC-1型微载体成功地培养了BHK-13,BHK-21,和CHO-KI三株细胞。当微载体浓度为5mg/ml,细胞接种量为30×10~4细胞/ml左右时,一般在三天都可达到1×10~6细胞/ml。此时接种10~(-1)或10~(-2)的VSV,在37℃培养20-24小时,病毒产量可达到6LogTCTD_(50)/ml以上,其中以CHO-KI细胞的产量最高,它们与静止培养的细胞产量基本一致,也不亚于鸡胚细胞增殖的产量。目前用该系统增殖的VSV已用于IFN的研究工作中。实验的结果也表明,用该系统增殖其它病毒和制备疫苗,以及大量培养已引入重组IFN基因的CHO工程细胞也将是可行的。     

人体细胞漫谈

人体细胞的数目人和所有行有性生殖的生物一样,都是由一个细胞——受精卵发育而来的.据推算,刚出生的婴儿全身约有二十万亿(2×10~(18))个细胞.经过二十多年的分裂生长,成人体内细胞约为三百万亿(3×10~(14))个. 据估算,人体神经系统内含有10~(11)个神经细胞(又叫神经元),仅大脑皮层就约含140亿个神经细胞.如果以成人体内血量平均为4.5升计算,成年男性体内红细胞约为2.25×10~(10)个(500万个/mm~3×4.5×10~3);女性体内红细胞约1.89×10~(10)个(420万个/mm~3×4.5×10~3;白细胞2.25×10~7～4.5×10~7个;血小板约为4.5×10~8～1.35×10~9个.     

成人外周血来源树突状细胞体外诱导培养动态监测

目的:分析体外诱导培养树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面分子及成熟度的动态变化;方法:利用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测分析DCs表面成熟标志分子CD83和T细胞辅助分子CD58、CD54、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、HLA-ABC表达水平;结果:体外诱导培养5 d细胞即高表达DCs标志分子CD11c,细胞成熟度与细胞表面T细胞辅助分子的表达水平随培养天数的增加有一定提高,但显著低于大肠杆菌LPS刺激的DCs;结论:诱导培养6 d DCs表型为CD83 low、CD58low、CD54 low、CD40 low、CD80 low、CD86 low、HLA-DRhigh、HLA-ABChigh,为不成熟DCs.