Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的:构建同源异性框基因Rhox5的真核表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定过表达Rhox5的细胞系。方法:PCR方法扩增Rhox5的全长cDNA序列,PCR产物双酶切后和人工合成的HA抗原表位标签共同克隆至pcDNA3.1(-)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Rhox5-HA融合表达质粒。脂质体法将经过测序成功的pcDNA-Rhox5-HA融合质粒和pcDNA3.1空载体分别转染NIH3T3细胞,潮霉素B筛选后建立阴性对照pcDNA3.1 in NIH3T3和稳定过表达Rhox5的Rhox5-HA in NIH3T3细胞系。RT-PCR和western blotting方法检测Rhox5-HA在稳定转染细胞系中的表达情况。结果:成功构建了pcDNA-Rhox5-Myc重组质粒,获得稳定过表达Rhox5的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达Rhox5-HA融合蛋白。结论:Rhox5基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达为进一步体外研究Rhox5蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了实验基础。     

MOB2基因在真核细胞中的表达研究

通过RT-PCR从培养的HUVECs中扩增MOB2基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。经RT-PCR扩增出734 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MOB2的多抗结合。成功地扩增了HUVECs中的MOB2基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。     

绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究

为了构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在293T细胞中的定位情况以及探讨是否可诱导NIH3T3细胞发生恶性转化,本研究采用RT-PCR技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中。构建好真核表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定。同时对exJSRV-env基因进行生物信息学分析。采用脂质体法将该重组质粒转染293T细胞,观察其在真核细胞中的表达及定位情况。将该重组质粒转染NIH3T3细胞,观察细胞是否发生恶性转化。用软琼脂集落实验检查转染重组质粒的NIH3T3细胞的生长状态。结果显示真核表达质粒构建成功并命名为pEGFP-C1/exJSRV-env。exJSRV囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区(TM区)的胞质尾区具有外源性病毒特有的YXXM基序。系统进化树也表明我们克隆的exJSRV-env基因属于致病性的外源性病毒。运用生物信息学技术分析env基因编码的蛋白质的基本性质,并预测其可能的结构。亚细胞定位表明exJSRV囊膜蛋白主要分布于细胞膜。转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒的NIH3T3细胞接触抑制性消失,可在软琼脂中形成集落。说明绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可引起NIH3T3细胞发生恶性转化。研究结果为进一步探讨exJSRV囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

食管癌细胞抗失巢凋亡基因UBCH7的发现与鉴定

失巢凋亡(Anoikis)是细胞失去与细胞外基质(Extra-cellular matrix, ECM)粘附时发生的特殊形式的凋亡, 是机体维持组织稳态的关键机制之一。抗失巢凋亡能力的获得是肿瘤细胞发生远处转移的前提条件之一。为了鉴定与食管癌细胞抗失巢凋亡相关的基因, 文章首先构建食管癌细胞系的逆转录病毒文库, 感染对失巢凋亡敏感的NIH3T3细胞, 利用感染病毒cDNA文库的混合细胞系进行软琼脂集落形成实验, 挑取在悬浮条件下仍可生长成为较大集落的细胞单克隆(潜在具有抗失巢凋亡能力的细胞), 通过逆转录病毒载体特异的引物PCR扩增失巢凋亡抗性克隆基因组中的插入cDNA片段, 以此获得食管癌细胞系cDNA文库中潜在的具有失巢凋亡抗性的基因。经测序发现其中一个失巢凋亡克隆中整合的cDNA片段包括人UBCH7/UBE2L3基因全长的编码序列(开放阅读框)。利用携带pMSCV-UBCH7的逆转录病毒感染NIH3T3细胞进行验证, 结果显示细胞失巢凋亡抗性增强, 并且在具有高转移潜能的食管癌细胞系MLuC1中降调UBCH7表达可减弱其失巢凋亡抗性。这些结果表明, UBCH7/UBE2L3是一个与食管癌失巢凋亡抗性相关的基因。     

食管癌细胞抗失巢凋亡基因UBCH7的发现与鉴定

失巢凋亡(Anoikis)是细胞失去与细胞外基质(Extra-cellular matrix,ECM)粘附时发生的特殊形式的凋亡,是机体维持组织稳态的关键机制之一。抗失巢凋亡能力的获得是肿瘤细胞发生远处转移的前提条件之一。为了鉴定与食管癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,文章首先构建食管癌细胞系的逆转录病毒文库,感染对失巢凋亡敏感的NIH3T3细胞,利用感染病毒cDNA文库的混合细胞系进行软琼脂集落形成实验,挑取在悬浮条件下仍可生长成为较大集落的细胞单克隆(潜在具有抗失巢凋亡能力的细胞),通过逆转录病毒载体特异的引物PCR扩增失巢凋亡抗性克隆基因组中的插入cDNA片段,以此获得食管癌细胞系cDNA文库中潜在的具有失巢凋亡抗性的基因。经测序发现其中一个失巢凋亡克隆中整合的cDNA片段包括人UBCH7/UBE2L3基因全长的编码序列(开放阅读框)。利用携带pMSCV-UBCH7的逆转录病毒感染NIH3T3细胞进行验证,结果显示细胞失巢凋亡抗性增强,并且在具有高转移潜能的食管癌细胞系MLuC1中降调UBCH7表达可减弱其失巢凋亡抗性。这些结果表明,UBCH7/UBE2L3是一个与食管癌失巢凋亡抗性相关的基因。     

人脑源性神经营养因子基因表达

用聚合酶链式反应(PCR)从人基因组DNA中扩增了人脑源性神经营养因子(hBDNF) cDNA和hBDNF成熟蛋白编码片段,分别克隆到pUC18中.经测序确认两个插入片段序列正确.hBDNF cDNA在CMV启动子控制下在NIH/3T3细胞中表达,用RT-PCR检测转染细胞确有BDNF mRNA存在.BDNF成熟蛋白编码序列在T7启动子控制下在E.coli中表达,SDS-PAGE表明,BDNF得到表达,以包涵体形式存在.     

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

多发性骨髓瘤恶性相关基因快速表达克隆法的建立

为从多发性骨髓瘤细胞中克隆与鉴定恶性相关基因并试图阐明其发病分子机制,建立了一种改进的快速表达克隆法,简单、快捷、直接从多发性骨髓瘤细胞株ARH-77 cDNA文库中克隆恶性相关基因。其特点是常用的表达克隆法与经典的DNA介导的NIH／3T3转染实验相结合,直接从cDNA表达文库中克隆恶性相关基因。首先建立高质量的cDNA表达文库,将cDNA表达文库分成几个基因池,转染NIH／3T3细胞;将转化活性最强的基因池再分成几个亚基因池,转染NIH／3T3细胞;将转化活性最强的亚基因池再分成次级亚基因池,直到获得有明显转化活性的单个cDNA克隆。该技术亦可用于从其他肿瘤细胞中克隆恶性相关基因。     

重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达

目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度.挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建; 用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段; 流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白; 经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白.     

Expression cDNA cloning of a transforming gene encoding the wild-type G alpha 12 gene product.

Using an expression cDNA cloning approach, we examined human tumor cell lines for novel oncogenes that might evade detection by conventional techniques. We isolated a transforming sequence that was highly efficient in transforming NIH 3T3 mouse fibroblasts. DNA sequence analysis identified the gene as the human homolog of a recently cloned alpha subunit of mouse GTP-binding protein G alpha 12. NIH 3T3 cells transfected with G alpha 12 cDNA grew in soft agar and were tumorigenic in nude mice. There were no apparent mutations in the cloned cDNA in comparison with a G alpha 12 cDNA clone isolated from a normal human epithelial cell library, implying that overexpression alone was sufficient to cause NIH 3T3 cell transformation. The observed altered growth properties mediated by G alpha 12 showed a certain degree of dependency on serum factors, and its mitogenic potential was also potently inhibited by suramin treatment.     

在NIH3T3细胞中高表达EDAG—1基因导致细胞恶性转化

探讨一种新近克隆的特异表达在造血系统组织和细胞中的胚胎发育相关新基因 (EDAG 1)的生物学功能。构建EDAG 1真核表达载体pcDNA3.1( ) EDAG 1,以脂质体法将其稳定转染入NIH3T3细胞中 ,结果发现高表达EDAG 1的NIH3T3细胞失去了正常的平行走向及接触抑制现象 ,侵袭力较正常增强约 10倍并获得锚定不依赖生长能力。将该细胞株皮下接种裸鼠 ,受鼠在 4周左右 10 0 % (6 / 6 )成瘤。这些结果表明EDAG 1是一种具有转化活性的新基因 ,可能与肿瘤发生、发展密切相关     

Transformation of NIH 3T3 cells by enhanced PAR expression

Prostate androgen regulated (PAR) is a 1038bp novel gene located on chromosome 1 in epidermal differentiation complex. The gene is ubiquitously expressed in normal tissues and is overexpressed in most of their malignant counterparts. PAR cellular function is unknown. Here we report the effect of increased PAR expression induced by transfection of PAR cDNA on NIH3T3 cell phenotype. PAR-NIH3T3 transfectants expressing 3- to 4-fold higher PAR levels compared to controls grew faster in tissue cultures, formed colonies in soft agar, and exhibited a shortening of G1 and S phases of cell cycle and formed tumors in SCID mice. Transfection of NIH3T3 cells with increased ectopic PAR expression with a 22 mer oligonucleotide in antisense orientation with PAR mRNA abrogated their ability to form colonies in soft agar. The data presented here along with our previously reported results on DU145 cells transfected with antisense PAR cDNA suggest that PAR gene behaves like a proto-oncogene.     

Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transforms NIH 3T3 cells.

Clinical evidence suggests that hepatitis C virus (HCV) is etiologically involved in hepatic cancer and liver cirrhosis. To investigate whether the HCV nonstructural protein NS3 has oncogenic activity, NIH 3T3 cells were transfected with an expression vector containing cDNA for the 5'- or 3'-half sequence of the HCV genome segment encoding NS3. Only cells transfected with the 5'-half cDNA rapidly proliferated, lost contact inhibition, grew anchorage independently in soft agar, and formed tumors in nude mice. PCR analysis confirmed the presence of the 5'-half DNA in the transfectants. These results suggest that the 5' region of the HCV genome segment encoding NS3 is involved in cell transformation.     

Transforming activity of the lymphotoxin-beta receptor revealed by expression screening

Pancreatic ductal carcinoma (PDC) remains one of the most intractable human malignancies. To obtain insight into the molecular pathogenesis of PDC, we constructed a retroviral cDNA expression library with total RNA isolated from the PDC cell line MiaPaCa-2. Screening of this library with the use of a focus formation assay with NIH 3T3 mouse fibroblasts resulted in the identification of 13 independent genes with transforming activity. One of the cDNAs thus identified encodes an NH(2)-terminally truncated form of the lymphotoxin-beta receptor (LTBR). The transforming activity of this short-type LTBR in 3T3 cells was confirmed by both an in vitro assay of cell growth in soft agar and an in vivo assay of tumorigenicity in nude mice. The full-length (wild-type) LTBR protein was also found to manifest similar transforming activity. These observations suggest that LTBR, which belongs to the tumor necrosis factor receptor superfamily of proteins, may contribute to human carcinogenesis.     

过表达Gankyrin基因细胞模型的建立及其成瘤性分析

目的：Gankyrin作为一个新的癌基因,在细胞周期调控和肿瘤发生过程中有重要功能。建立Gankyrin过表达的细胞和动物模型,以便进一步研究其在肿瘤形成过程中的作用机制。方法：采用逆转录病毒感染细胞的方法构建Gankyrin稳定表达的细胞株,采用Western-blot检测Gankyrin的表达,采用软琼脂和裸鼠成瘤实验验证该细胞株的恶性转化效应。结果：构建了Gankyrin稳定过表达的NIH3T3细胞株,且该细胞株具有成瘤性。结论：采用逆转录病毒感染细胞的方法可以有效建立Gankyrin转化细胞株,为进一步研究Gankyrin的作用机制及其在肿瘤形成中的功能提供了基础。     

EphA3基因稳定表达细胞模型的建立与分析

目的：建立稳定表达外源EphA3基因的小鼠成纤维细胞株模型,初步探讨EphA3基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法：通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1（-）/myc-his-EphA3转染NIH3T3细胞,用Western印迹确定外源EphA3基因表达;通过MTT实验、软琼脂集落形成实验,观察EphA3基因表达对NIH3T3细胞生物学特性的影响。结果：建立了稳定转染EphA3基因的NIH3T3细胞株;EphA3基因表达的小鼠成纤维NIH3T3细胞生长速度没有明显变化,但在软琼脂上锚着非依赖生长的能力加强。结论：建立了稳定表达外源EphA3基因的NIH3T3细胞株,EphA3基因稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。