芒果炭疽病菌β-微管蛋白基因的克隆及其与多菌灵抗药性发生的关系

参照豆科合萌属 (Aeschynomene)作物炭疽病菌的tub1和tub2基因序列设计了 2对引物 ,分别从芒果 (Man gifera)炭疽病菌对多菌灵 (MBC)田间抗药性 (MBCR)和敏感 (MBCS)的菌株中扩增 β_微管蛋白基因。结果只有以tub2为参照设计的引物扩增到了特异片段。进一步对全基因进行了克隆和测序。该基因序列全长 1344bp ,编码4 4 7aa ,其核苷酸和氨基酸序列与豆科合萌属炭疽病菌的tub2基因高度同源。对芒果炭疽病菌抗、感菌株 β_微管蛋白氨基酸序列进行比较分析 ,发现第 181、2 37和 36 3位氨基酸发生了突变 ,而其它位置 (如第 198位或 2 0 0位 )均不变     

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果,发现存在14个保守的氨基酸残基,其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域,在空间上可形成两对二硫键,推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2,使mLEAP2基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,在25℃下,经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后,成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,细胞经超声破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

组甲硫肽可能是人的催乳素释放激素

Tatemoto等1982年曾报道,由猪胃肠道中分离出与血管活性肠肽(VIP)相同基因编码的组异亮肽(pep i de histidine isoleucine,PHI);并发现在体内和体外试验中它都能强烈刺激催乳素释放。以后又证实.在大鼠垂体门脉血浆中也存在有PHI,因此推测,PHI是一种催乳素释放激素。最近依据编码VIP的mRNA核苷酸序列已推断出人前VIP原(preprovasoactive intestinal peptide)的氨基酸顺序,并发现VIP前体蛋白不仅在它的C末端部位含有VIP分子,而且在其中间部位还含有组甲硫肽(peptide histidine methio nine,PHM)。这种新发现的FHM与PHI一样也由27个氨基酸组成,但是人的PHM中有2个氨基酸与     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶cDNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶 (PEL) .在测定了其N端 12个氨基酸残基序列的基础上 ,通过RT PCR、5′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得了PEL完整的cDNA序列 (GenBank登录号为AF2 84 0 6 4 ) .cDNA全长 10 5 0bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区cDNA由 85 5个碱基组成 ,编码 1个由 2 85个氨基酸残基组成的酶蛋白 ,其信号肽及前肽部分由 2 7个氨基酸残基组成 ,成熟肽部分由 2 5 8个氨基酸残基组成 .根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量为 2 7 3kD .该脂肪酶的氨基酸序列 130～ 134位上有各类脂肪酶中普遍存在的G X S X G保守序列     

26肽蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

在E .coliDH5α中表达26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser)₃,构建嵌合体蛋白的基因,克隆到原核表达载体pGEX4T-2中,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS-PAGE与Western-blot鉴定。结果表明重组蛋白有良好的抗原性 。     

前体mRNA剪接蛋白Tra2β1的抗体制备及鉴定

Tra2 β1是Tra2 β前体mRNA剪接调节蛋白家族中的一个组织分布最广、表达量最多的成员 ,它在选择性前体mRNA剪接中有调节功能 ,而在基础性剪接中不是必需的 .为便于对该蛋白功能的进一步研究 ,需要制备能特异地检测Tra2 β1蛋白的抗体 .选择包含Tra2 β1的N端 12个氨基酸的特异编码序列的Tra2 β2全长编码序列 (共 117个核苷酸 ) ,将其克隆至pGEX 3X表达载体形成GST融合基因 ,并以诱导表达和纯化的该融合蛋白为抗原免疫新西兰兔 ,获得了相应的抗体 .Western印迹和免疫细胞化学分析结果显示 ,获得的抗体能特异地检测Tra2 β1蛋白     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶基因的克隆与鉴定

根据GenBank猪链球菌2型(SS2)报道序列,对江苏分离株SS2-H部分测序,发现位于已知毒力基因orf2与mrp之间存在两个新的开放阅读框序列。选取可能含有抗原决定簇肽段对应的核酸序列,该阅读框(2738~3694)编码319个氨基酸残基,分子量为33.5kDa,与已知任何基因无同源性。通过InterPro、PHD、DNAstar分析阅读框,并定向克隆至pET-32α( )载体中,转化至大肠杆菌BL21,表达出分子量为48kDa的融合蛋白,蛋白免疫转印可被SS2的抗血清识别,具有免疫原性;并且含有IMP dehydrogenase结构域,催化IMP生成XMP;流式细胞仪检测该蛋白可明显影响HEp-2细胞周期。     

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.     

大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

我们由E.coli AS1.76克隆了青霉素G酰化酶的基因,并且测定了其全部核苷酸序列。青霉素G酰化酶结构基因是由下述功能片段组成的:(1)编码信号肽(26个氨基酸残基)的78个碱基对;(2)编码α-亚基(209个氨基酸残基)的627个碱基对;(3)编码间隔肽(54个氨基酸残基)的162个碱基对;(4)编码β亚基(557个氨基酸残基)的1671个碱基对。此外,我们还发现起始密码子(ATG)前有个核糖体结合位点和启动子序列以及在终止密码子(TAA)之后有个转录终止信号。与最近发表的青霉素G酰化酶基因的DNA序列比较,同源性达99.7%。     

鸡importin β1基因的克隆及生物信息学分析

[目的]对鸡importin β1基因进行克隆和生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的鸡importin β1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importin β1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构和系统进化树进行分析。[结果]鸡importin β1基因CDS全长2 268bp,共编码755个氨基酸,该蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importin β1蛋白含有丰富的二级结构,以α-螺旋为主(占64.90%)。importin β1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。[结论]鸡importin β1基因的克隆和生物信息学分析为进一步研究其功能奠定了基础。     

人肽抗生素hPAB—β分子的同源模建及其突变体设计

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,经药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性。旨在通过同源模建的方法 ,构建肽抗生素hPAB β的突变体分子 ,希望获得肽链更短 ,但生物活性不降低甚至更强的突变体。方法是在序列比较的基础上 ,利用同源分子对目的肽抗生素hPAB β进行同源模建 ,在此模型上 ,删除某些氨基酸后观察目的分子立体结构模型改变情况 ,从而确定突变体分子结构。同源模建结果表明hPAB β由一个α螺旋和 3个 β片层构成 ,二级结构保守 ;具有两亲性结构 ,推测与目的肽进…     

绵羊fertilin β基因编码区的钓取与结构分析

Fertilin β与精卵的结合和融合有密切关系。为探讨fertilin β蛋白在绵羊受精过程中的作用机理, 采用RACE技术, 首次钓取了该基因的编码区。结果绵羊fertilin β基因的编码区cDNA全长为2,217 bp。同源性分析显示, 绵羊的fertilin β氨基酸序列与牛、猪和人的fertilin β具有79.4%、66.7%和58.1%的同源性。系统发育分析表明, 绵羊fertilin β与牛属于同一分支, 并且也显示了绵羊和牛分类地位最近, 这和传统的分类一致。Fertilin β蛋白结构域分析显示, 绵羊fertilin β去整合素识别序列为TDE, 与牛的序列相同。除了上述三肽序列外, 紧随X-D/E-E的ECD保守序列, 从而形成了X-D/E-ECD五肽保守序列, 在绵羊fertilin β中该五肽序列为TDECE。     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gIII部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列。进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。     

重组人β趋化因子RANTES基因融合表达产物活性分析

为研制基于病毒受体的抗艾滋病毒感染基因药物 ,将重组人 β趋化因子RANTES基因导入大肠杆菌中表达谷胱甘肽S 转移酶 (GST) RANTES融合蛋白 ,并回收携带末端延伸肽 (TEP)的RANTES修饰蛋白 .荧光免疫化学分析表明 ,2种非天然RANTES蛋白均显示对人外周血淋巴细胞的结合活性 .暗示在细胞表面可能已发生RANTES与CCR5之间的相互作用 .2种修饰RANTES蛋白都能使人外周血细胞的过氧化物酶活性显著升高 ,提示这 2个人造蛋白可能仍存在对淋巴细胞的趋化性诱导 .     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

CART 肽:一种新的与成瘾和进食相关的神经肽

近年来 ,科学家们发现 ,可卡因和安非他明可使大鼠纹状体中ＣＡＲＴｍＲＮＡ的水平显著增高 ,此后早已在脑中被找到的ＣＡＲＴ蛋白片段才受到重视 ,遂将此蛋白命名为ＣＡＲＴ(ｃｏ ｃａｉｎｅａｎｄａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ,受可卡因和安非他明调节的转录产物 )。大鼠主要含有大、小两个ＣＡＲＴ片段 ,人类只有其中含 1 1 6个氨基酸的短片段。人类ＣＡＲＴ基因位于 5号染色体上 ,其ＣＡＲＴｃＤＮＡ序列与大鼠ｃＤＮＡ有 80 %相同。ＣＡＲＴ肽存在于神经元的轴突末端和致密小泡中 ,且在人、猴、大鼠的…     

传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

以5株传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)单克隆抗体HNF1、HNF7、B34、2B1和2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,用间接ELISA检测,A值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位.选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列.进一步将其与GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu-Ala-Ser-Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536-599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1、HNF7、B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位.     

细胞因子对GH3细胞中人生长激素基因表达的影响

为了研究细胞因子IL 11、睫状神经营养因子 (CNTF)和转化生长因子 (TGF β)对大鼠垂体GH3 细胞中人生长激素 (hGH)的基因启动子活性的影响及其与垂体特异性转录因子Pit 1蛋白的关系 ,首先建立含hGH基因启动子 (- 4 84～ 30bp)和荧光素酶融合基因的稳定转化GH3 细胞系 ,然后用细胞因子刺激 ,检测细胞培养液和细胞裂解液中GH的含量 ,反映它们对GH分泌和合成的影响 ;检测GH3 细胞内荧光素酶的变化 ,说明细胞因子对hGH基因启动子活性的作用。将Pit 1蛋白表达质粒 (pcDNA pit 1 cDNA)单独转染或与Pit 1反义寡核苷酸 (Pit 1OND)共转染于稳定转化的GH3 细胞中 ,观察加入细胞因子后荧光素酶的变化 ,探讨细胞因子的作用与Pit 1蛋白的关系。结果表明 ,IL 11(2 0nmol/L)、CNTF(10nmol/L)能刺激大鼠垂体GH3 细胞中GH的分泌和合成 ,增强GH3 细胞中荧光素酶的表达 ,分别增加到对照组的 12 6 %、136 %。TGF β(5nmol/L)能减少GH的分泌和合成 ,抑制荧光素酶的表达到对照组的 77%。Pit 1蛋白过表达和表达被抑制对细胞因子的调节作用没有影响。这说明IL 11、CNTF和TGF β可通过调节大鼠垂体GH3 细胞中hGH基因启动子活性影响GH的合成 ,Pit 1蛋白可能不参与这些调节作用。