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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆 … 总被引:3,自引:2,他引:3
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株TPI基因的克隆及其表达产物特性 总被引:2,自引:2,他引:2
磷酸丙糖异构酶(TPI)是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的TPIcDNA序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法快速克隆出一大小约800bp的DNA片段。DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjTPIc)基因。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约54kD。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达30mg/L培养物。免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,是一种较为理想的抗原分子。 相似文献
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单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶 总被引:1,自引:0,他引:1
溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。 相似文献
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其用作疫苗分子创造了条件。 相似文献
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在重组DNA实验中,获得高纯度的质粒DNA是构建载体所必须的步骤之一。目前,国内外多数实验室沿用氯化铯梯度离心法纯化质粒DNA,本文介绍了一种改进的提取和纯化质粒DNA方法,简便易行。 材料和方法 材料 RNase(Oxioid England),胰蛋白胨(Oxioid England),琼脂糖(Sigma Ⅰ型),BamHI(Bio Lab)。其它试剂均为国产分析纯。所用菌种为E.coli JA221(hsd R.trp E5.Leu 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株22.6kD膜相关蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌?… 总被引:1,自引:0,他引:1
以日本血吸虫mMRA为模板,用RT-PCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫22.6膜相关蛋白基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸 相似文献
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《生物技术通报》1993,(4)
931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围… 相似文献
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本文介绍一种从重组质粒中快速提纯DNA插入片段的方法。质粒DNA的制备简单、快速、分离的质粒DNA可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等。从琼脂糖凝胶中提纯DNA插入片段的方法操作简单,回收效率高,提纯的DNA片段可用于连接和制备杂交探针等。 相似文献
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以日本血吸虫mRNA为模板,用RTPCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫226膜相关蛋白(Sj226(Ch))基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件。 相似文献
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目的:利用原核细胞体系表达并纯化B细胞连接蛋白(BLNK)。方法:构建pMAL-c5x-BLNK重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(Plyss),IPTG诱导BLNK融合蛋白的表达,通过MBP柱亲和纯化获得目标蛋白,进行12%SDSPAGE分析。结果:构建了BLNK的原核表达质粒pMAL-c5x-BLNK,该质粒在IPTG浓度为0.5 mmol/L、温度为11℃的条件下,可以在大肠杆菌BL21(Plyss)中表达高纯度的BLNK。结论:在原核细胞表达体系中表达并制备了高纯度的BLNK,为下一步研究BLNK的相互作用蛋白和分子结构打下了基础。 相似文献
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紫色非硫细菌质粒的制备与性质 总被引:2,自引:0,他引:2
介绍一种适于紫色非硫细菌质粒的制备方法,该法简单,易操作,质粒DNA纯度好,收率高,通过在加富培养基上连续传代数次,质粒DNA可自行消除。 相似文献
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[背景] 大量制备高纯度的重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV),是以腺相关病毒(AAV)为投递载体的基因靶向治疗或基因工程药物研发过程中需要解决的重要问题。[目的] 利用层析柱法大量纯化质粒和rAAV细胞培养液,以获得高纯度的rAAV颗粒。[方法] 对组装rAAV的3种质粒用HiPrepTM10 Sepharose 6FF和HiTrap PlasmidSelect Xtra凝胶层析柱纯化,目的是得到组装AAV的超螺旋质粒DNA,然后对组装rAAV过程中的AAV-293细胞培养方法进行优化,组装成功病毒后,再对收集到的细胞提取液用HiLoadTM10Q和HiLoadTM10SP阴阳离子交换层析柱纯化,最后用纯化浓缩后的rAAV感染HT1080细胞,通过流式细胞仪检测荧光表达细胞数,计算浓缩后活病毒感染滴度。[结果] HiPrep和HiTrap层析柱纯化后得到大量高纯度的超螺旋质粒DNA,组装病毒后,用HiLoad柱纯化获得大量高纯度的rAAV颗粒,通过测定,rAAV基因组滴度达到(2.46±0.37)×1012 TCID50/mL (MOI=1.0×104)。[结论] 通过一系列精细化组装纯化制备出高纯度、高滴度rAAV病毒颗粒。 相似文献
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本文介绍一种简单快速分离质粒DNA方法。此方法有两个主要步骤。用这种方法分离的质粒DNA纯度高、无RNA,并可用于酶切、连接等操作。 相似文献
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一种提取质粒DNA的改良方法 总被引:16,自引:1,他引:16
本文详细介绍了一种改良碱裂解法提取质粒DNA的方法,该法采用NH4Ac代替苯酚和氯份的抽提过程,得率高,质量好,完全达到了分子生物学常规实验的要求,如酶切、连接、转化大肠杆菌、PCR等,甚至用于序列测定和植物遗传转化,该法重复性好,操作简单、实用. 相似文献
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重组人肝再生增强因子在体外能刺激HTC肝癌细胞DNA合成 总被引:11,自引:0,他引:11
在成功克隆人肝再生增强因子(hALR)cDNA的基础上,本研究将人ALR编码区cDNA亚克隆于真核瞬间表达质粒pCDNA I,构建了真核表达质粒pCDNA I-hALR,转染cos-7细胞后,表达产物生物活性检测表明:真核表达的hALR在体外能刺激HTC肝癌细胞增殖,这一体外活性的确定为重组人ALR的纯化提供了简洁、可靠的检测方法。 相似文献
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抑瘤素M cDNA的克隆及表达研究 总被引:1,自引:0,他引:1
抑瘤素M是一种我功能的细胞生长调节因子,从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的CDNA;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PBV220后再转化DH5α进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5%,经过初步纯化的OSM能明显抑制A 相似文献
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齐义鹏 《生物化学与生物物理进展》1985,12(1):57-59
质粒的研究在遗传工程上占有重要地位。其分离纯化是一项费工费时和得率甚微的工作。一般常用的方法有制备性电泳,平衡等密度超离心和速度区带超离心等,这些方法各有特点,作者对它们进行了比较。质粒DDNA从苏芸金杆菌(Bacillus thuri-ngiensis)变种 isvaelensis 4Q_2-22和变种 相似文献