运用多种策略改良差异显示PCR

目的：改进差异显示PCR技术,提高其在筛选差异表达基因方面的效率。方法：①采用单碱基金铆钉引物;②增加引物长度;③提高PCR反应的严谨性;④应用同步重复测序电泳。结果：减少经典方法的工作量,降低了非特异性和假阳性率。用改良技术研究热适应大鼠下丘脑基因的差异表达,发现了一个差异表达基因片段,斑点杂交证实为阳性片段。结论：改进后的差异显示PCR技术是一种研究基因差异表达从而发现新基因或基因新功能的有效方法。     

利用mRNA荧光差异显示技术规模化筛选棉纤维特异表达基因

以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种TM-1开花后9d、21d、27d三个不同发育时期的棉花纤维为材料,利用mRNA荧光差异显示 (FDD) 技术,筛选到109个差异显示的cDNA片段。在此基础上,结合两轮反Northern杂交筛选和Northern杂交分析,获得了多个仅在棉花纤维细胞中特异表达或在纤维中优先表达基因的cDNA片段,序列测定和数据库搜索分析表明,这些cDNA片段中的多数还未有报道。本工作为克隆上述基因的全长cDNA,并进一步研究它们在棉纤维发育中的功能奠定了基础。     

荧光标记mRNA差异显示技术

目的：应用荧光标记的ｍＢＮＡ差异显示技术。方法：提取未经过／经过ＩＦＮ－ＬＰＳ处理的三组人单核细胞系Ｕ９３７的总ＲＮＡ并以此为模板,采用荧光标记的锚定引物,通过逆转录、差异显示ＰＣＲ反应,经５．６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异条带,回收后将其再扩增。结果：三组样本的ＤＤ－ＰＣＲ产物电泳显示长３００ｂｐ￣２．０ｋｂ不等的扩增片段,条带清晰、明亮,背景低,各样本相互间的差异不仅呈有无的变化,亦表现出     

用银染mRNA差异显示进行基因筛选

介绍一种简便、快速的mRNA差异显示法银染法。并对在逆转录时总RNA加入的量、dNTP的浓度、银染的条件、差异条带的回收及再扩增等方面作了探讨和改进。实验表明,用银染进行mRNA差异显示具有快速、简便、经济、可靠性高等优点。为新基因的发现和克隆提供了有用的手段。     

差异显示技术在橡胶树分子生物学研究中的应用

差异显示技术是从分子水平研究细胞、组织、器官中基因结构和表达变异的手段之一,在巴西橡胶树研究中也已有应用。本文从DNA、RNA和蛋白质水平上介绍了近年来差异显示技术在橡胶树分子生物学研究中的进展,并对其前景作了展望。     

mRNA差异显示技术在动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用

动物从卵裂开始的早期胚胎发育始终伴随着mRNA不断的合成与降解。最初受着受精卵内母体mRNA的控制。当这些mRNA在发育过程中逐渐被降解时,有些动物（如小鼠）在比较早的时期已有新的基因的转录;而有些动物（如鱼类、两栖类）迟到囊胚中期以后,合子核的基因才开始转录新的mRNA。mRNA这各肯规律的代谢活动控制着细胞的分化、层的形成以及模式形成（pattem formation)。所有这些mRNA水平上的变化都可以用mRNA差异显示法（mRNA differential displsay)检测出来并进而获得与早期胚胎发育有关的基因。mRNA差异显示法是由Liang和Psardee于1992年建立起来的,用于显示两种不同组织之间mRNA差异的方法。基于绝大多数mRNA有一个poly(A)尾巴,选用一个较特殊的3’端引物－5’T11MN3’,其中M可以是dATP,dCTP,dGTP之一,而N可以是dATP,dTTP,dGTP之一,进行逆转录时,1／12的RNA可被逆转录为cDNA。这种cDNA第一链被用来PCR扩增,所使用的3’端引物与逆转录引物相同,而5’端引物为10个碱基的一个寡核苷酸,这类任意（aritrary)引物共有26种。这样,当我们利用一对引物进行RT－PCR时,1／312（12X26＝312）的mRNA可以被显示出来。将来自不同发育阶段胚胎的总RNA的RT－PCR产物在6％的聚丙烯酰胺变性胶上平等走电泳、放射自显影后即可知道胚胎之间在mRNA水平上的差别,然后从cDNA文库中钓取全长的cDNA或从基因文库中筛选完整基因并对其序列、结构、功能等方面进行研究,从而揭示不同发育阶段胚胎间性状上差异的根源。mRNA差异显示技术已在小鼠、大鼠、斑巴鱼、抓蟾等动物的早期胚胎发育基因的研究中得了应用,取得了较好的结果。     

mRNA差异显示技术及其应用

mRNA差异显示技术是国外最近发展起来的一种分离表达水平出现差别的基因的新技术。目前已广泛用于人类及其他动物生长发育基因调控、基因克隆研究,也开始用于植物基因分析、杂种优势机理等方面研究。本文综述这一新技术原理、实验步骤、应用及问题与展望。     

Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因的mRNA差异显示分析

目的：应用差异显示技术,筛选鼻咽癌相关基因的异常表达。方法：选用连接有bax基因的真核表达质粒pSFFV-bax-neo, 采用脂质体转染法, 将其转染到CNE2细胞中, 以转染有空载的pSFFV-neo 质粒的CNE2细胞为对照, 采用Trizol试剂快速抽取法, 提取mRNA经逆转录成cDNA,用锚式引物和随机引物进行PCR扩增, 加入同位素, 用6%的测序变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳PCR产物进行分离。切下聚丙烯酰胺凝胶上明显的6条差异带, 回收差异cDNA, 进行第二次PCR扩增, 经低溶点琼脂凝胶回收, 获取大量PCR扩增的差异cDNA片段,同位素标记作为探针, 抽取RNA, 进行点样, 杂交, 洗膜放射自显影等步骤, 进行细胞RNA的Northern印迹斑点杂交。结果：表明4条cDNA片段均为CNE2细胞表达片段。结论：发现bax可诱导CNE2细胞中有某些相关基因表达,并抑制了CNE2细胞某些相关基因表达。     

mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因

克隆功能基因是研究植物基因结构及功能的重要途径,利用mRNA差异显示技术,筛选获得了中国葡萄属野生种华东葡萄白河-35-1在人工接种白粉菌前后差异表达基因的cDNA片段Vprdrf4。经Northern杂交验证,该片段为正调控片段,Blaset检索表明与真核生物核糖体RNA基因的同源性高达90%以上,GenBank登录号为CD347664。     

克隆未知基因的新方法——mRNA差异显示技术

高等生物大约有１０万个不同的基因,但只有１５％的基因在任何个体的细胞中都表达。选择哪个基因表达决定了生命历程中的许多重要环节,如：细胞的发育、分化、应激、细胞周期调节、衰老和细胞凋亡。因此,对不同类型、不同时期细胞的基因表达情况进行比较研究,可以获得...     

Recovering and reamplifying of the differentially expressed cDNA bands isolated from mRNA differential display

Methods for retrieving and reamplifying the differentially expressed cDNA bands have been modified. Direct reamplification of differentially expressed bands after cutting from a polyacrylamide gel (PAG) followed by a simple rinse and crush step has proved to be more convenient and effective than the traditional glycogen-precipitation method. Combination of 30 cycles of differential display (DD) polymerase chain reaction (PCR) and 20 cycles of standard PCR reaction also yielded higher reamplification rates.     

mRNA差异显示条件的优化

运用优化的mRNA差异显示技术分离受内生真菌诱导的差异基因。优化差异显示条件表现在增如指定引物和随机引物的长度、改变PCR参数和再扩增程序、运用银染显色等。应用这些条件共获得7个阳性差异片段。用未优化的PCR程序1筛选35条差异带,得到3个两端均为随机引物的差示片段。而用优化的PCR程序2,52条差异带中得到9条只能用锚定引物和随机引物才能扩增出的片段。地高辛标记的反向-Northern鉴定为阳性后进行克隆和测序。PCR方法1所得的3个差示片段均无开放的阅读框。PCR程序2得到7个差异表达的基因中,2个为已知基因,5个为未知基因。因此可运用优化的差显技术分离差异表达的基因。     

Identification of differentially expressed genes in human uterine leiomyomas using differential display

INTRODUCTIONUterine leiomyomas (ULs) have been consideredto be of uniceIIular origin[l1. It is one of the mostcommon benign tumors, occurring in 20% to 30% ofwomen[2], accounting for significant morbidity andusually need major surgery[3] which might causesome side effects afterwards[4]. Therefore, to de-velop certain drug treatments instead has been thehope of these patients for a long time. Using alter-native approaches fOr studying patients sufferingfrom leiomyoma in various ethnic gr…     

Identification of new early auxin markers in tobacco by mRNA differential display

Differential display of mRNA has been improved by developing a two-step PCR amplification procedure. The modified differential display has been applied to identify early alterations of mRNA expression in response to auxin treatment of tobacco seedlings. This approach has led to the isolation of four fragments corresponding to auxin-up-regulated mRNAs. One, named GO15-13, shows significant homology with the 3 end of the coding region of the soybean SAUR X10A [10]. The three other fragments present no homology with sequences available in the databases and constitute potential new early auxin markers.     

mRNA差异显示RT-PCR技术在昆虫学研究中的应用

mRNA差异显示RT- PCR是近 1 0年广泛使用的用于克隆和分析差异表达基因的有效技术。该文简要介绍了差异显示RT -PCR技术的原理、优缺点及其优化方法 ,重点综述了mRNA差异显示RT -PCR技术在昆虫学研究中的应用。     

Isolation of pathogen/stress-inducible cDNAs from alfalfa by mRNA differential display

Differential display of mRNA was used to isolate a full-length (SRG1) and a partial (SRG2) alfalfa cDNA induced during infection with the fungal pathogen Colletotrichum trifolii. The deduced amino acid sequences are similar to each other and resemble plant defense-related proteins and tree pollen allergens. SRG1 is a member of a gene family in alfalfa, which may also include the putative defense-related gene PR10. Unlike many defense-related genes described in similar systems, expression of SRG1-like genes does not correlate with resistance to C. trifolii. We speculate SRG1 is induced in response to plant stress.     

mRNA差别显示技术对肝再生调控基因的研究

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理。得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,其一在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝。这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973。     

mRNA差别显示技术及其在生命科学中的应用

ｍＲＮＡ表达水平的变化决定细胞的功能状态,个体发育、细胞增殖分化与凋谢、生理刺激和药物治疗等过程,都会出现ｍＲＮＡ 表达水平的变化。阐明这种变化有助于揭示细胞生理过程的分子机制。该技术无需更多的背景资料,可快速有效地分离表达水平出现差别的基础,这些基因编剧编码的功能多肽在细胞生理过程中扮演着重要角色。