bcl-2高表达细胞株的构建

利用基因转染技术,将人的bcl-2基因cDNA克隆于逆转录病毒载体pLXSN,通过PA317细胞包装成病毒后感染HeLa细胞。经PCR及蛋白质印迹证明转染成功,得到bcl-2稳定高表达株Hbc17。用顺铂诱导凋亡,Hbc17比对照细胞株H1具有明显的抗凋亡能力。为进一步研究顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的机理奠定基础。     

CCCTC-结合因子与核周蛋白α4存在分子间相互作用并调控其基因表达

目的:研究CCCTC-结合因子(CTCF)是否与核周蛋白α4(KPNA4)有蛋白间相互作用并调控其表达。方法:用GSTpull-down实验研究CTCF是否与KPNA4存在蛋白间相互作用;用逆转录半定量PCR和免疫印迹检测CTCF敲降对KPNA4基因表达的影响。结果:GSTpull-down实验表明CTCF与KPNA4之间存在相互作用;当CTCF敲降时,KPNA4基因的表达随之下降。结论:CTCF与KPNA4之间存在相互作用并调控其基因表达。     

miR-186-5p在酒精诱导的心肌细胞中高表达并通过靶基因XIAP调控细胞凋亡水平

目的:证实酒精可诱导AC16心肌细胞凋亡及其与酒精浓度和作用时间的关系,研究不同浓度酒精干预下AC16心肌细胞中miR-186-5p与X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达水平以及心肌细胞凋亡水平的改变,探究miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。方法:流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot、实时定量PCR技术分别在蛋白质及基因水平检测细胞miR-186-5p与XIAP表达水平的变化,双萤光素酶报告基因靶基因荧光检测miR-186-5p与XIAP的靶际关系。结果:酒精诱导AC16心肌细胞发生凋亡,且与酒精浓度及作用时间呈正相关;酒精摄入上调AC16心肌细胞中miR-186-5p表达,下调XIAP表达; miR-186-5p参与酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡过程,XIAP抑制酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡; miR-186-5p以XIAP为靶基因调控酒精诱导的心肌细胞凋亡。结论:AC16心肌细胞经过酒精处理后,细胞的凋亡水平升高,并且随着酒精作用浓度和作用时间的延长,凋亡水平进一步升高;酒精处理后心肌细胞中miR-186-5p表达量上调,XIAP表达量下调,miR-186-5p以XIAP为靶基因,调控酒精处理后心肌细胞的凋亡。     

rno-miR-9a-5p靶向Egln3调控嗜铬细胞瘤凋亡机制

[目的]探讨嗜铬细胞瘤抵抗细胞凋亡的潜在机制。[方法]顺铂处理或不处理嗜铬细胞瘤细胞PC-12后,通过蛋白质组学检测两者蛋白表达差异。通过siRNA敲低上述差异基因,检测嗜铬细胞瘤细胞PC-12的凋亡水平。[结果]顺铂处理后,BIM和Egln3蛋白表达量增高,Egln3的mRNA水平显著上升(P<0.05)。过表达Egln3后,BIM的表达显著上升。敲低Egln3后,BIM的表达显著下降。Egln3能够降低BIM的泛素化水平。敲低BIM和Egln3后嗜铬细胞瘤的凋亡水平显著上升(P<0.05)。过表达BIM和Egln3后,嗜铬细胞瘤的凋亡水平显著下降(P<0.05)。过表达rno-miR-9a-5p后,Egln3的表达水平下降。敲低rno-miR-9a-5p后,Egln3的表达水平上升。过表达rno-miR-9a-5p后,嗜铬细胞瘤凋亡水平上升(P<0.05);敲低rno-miR-9a-5p后,嗜铬细胞瘤凋亡水平下降(P<0.05)。[结论]rno-miR-9a-5p通过靶向Egln3及Egln3的mRNA,降低了Egln3的蛋白表达,抑制了蛋白酶体途径对...     

CCCTC-结合因子的表达水平影响其在细胞内的分布

目的:研究CCCTC-结合因子(CTCF)的表达水平与其在HeLa和HepG2细胞内分布的关系。方法:利用小干扰RNA敲降CTCF的表达;利用免疫荧光染色检测CTCF在细胞内的分布。结果:在HeLa和HepG2细胞中下调CTCF的表达,检测到CTCF在细胞核内的分布比例减少,而在细胞质内的分布比例相应增加。结论:CTCF的表达水平会影响其在细胞内的分布。     

XIAP在胰腺癌化疗耐药及治疗中的研究进展

X连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中的一员,具有抗凋亡作用.研究发现XIAP在胰腺癌中呈高表达,并且能诱导胰腺癌细胞及组织对化疗耐药.通过在基因水平及蛋白水平降低XIAP的表达对胰腺癌的治疗具有重要意义.AEG 35156是针对XIAP的反义寡核苷酸分子,能够抑制胰腺癌细胞及组织生长.RNAi能够稳定下调胰腺癌细胞中XIAP水平,从而加强TRAIL诱导的细胞凋亡,并能提高胰腺癌细胞对化疗的敏感性.针对XIAP的小分化合物能够抑制XIAP的功能,释放被XIAP抑制的凋亡起始和效应分子以及XIAP抑制的其他促凋亡蛋白,提高多种肿瘤细胞的凋亡指数及对放化疗的敏感性.XAFl能抑制XIAP的抗凋亡作用.本文就XIAP在胰腺癌化疗耐药及治疗中的研究进展做一综述.     

Genistein增加顺铂诱导的SKOV-3细胞的凋亡与活性氧的关系

目的:探讨Genistein增加顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞SKOV-3凋亡的可能作用机制.方法:倒置相差显微镜下观察药物处理后细胞形态学的变化;MTT比色法检测不同药物处理后对SKOV-3细胞增殖的影响;流式细胞仪检测药物处理后细胞的凋亡情况;流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内活性氧(ROS)的水平.结果:10ug/ml的Genistein和2.5ug/ml的顺铂联用24h后,引起了细胞内ROS的增加,细胞的凋亡率也显著增高,与单用顺铂组相比差异有显著性(P＜0.05);用NAC预处理细胞2h后,有效抑制了ROS的产生,并增加了细胞的活性,降低了细胞的凋亡率,与未加NAC组相比差异有显著性(P＜0.05).结论:Genistein增加顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞SKOV一3的凋亡与细胞内ROS水平的升高有关,这可能是Genistein增加顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞SKOV-3凋亡的作用机制之一.     

前列腺癌干细胞拮抗剂盐霉素对人前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响

为了探讨前列腺癌干细胞拮抗剂盐霉素对人前列腺癌PC3细胞增值、凋亡和迁移的影响,本研究用前列腺癌干细胞拮抗剂盐霉素处理人前列腺癌PC3细胞,用CCK-8检测细胞的增殖能力,用流式细胞术检测细胞的凋亡状况,蛋白免疫印迹技术检测凋亡蛋白Bax和Bcl-2,划痕实验检测细胞迁移。用前列腺癌干细胞拮抗剂盐霉素处理人前列腺PC3细胞后,其细胞增殖能力显著下降,凋亡细胞显著增加,促凋亡蛋白Bax的表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低,且细胞划痕修复率显著降低。前列腺癌干细胞拮抗剂盐霉素可诱导人前列腺癌PC3细胞活力降低、凋亡增多和迁移抑制。     

过氧化物酶V在顺铂诱导HepG2肝癌细胞凋亡过程中的调控作用

过氧化物酶V(peroxiredoxin V, Prx V)是过氧化物酶家族(peroxiredoxins, Prxs)中的一员,具有清除细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的功能。该文主要阐明了Prx V在顺铂(cisplatin, CDDP)诱导Hep G2人肝癌细胞凋亡过程中的调控作用。该研究利用顺铂处理Hep G2肝癌细胞,通过荧光显微照相、流式细胞术、蛋白质免疫印迹分析等方法检测细胞内活性氧(ROS)水平、细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白水平。研究结果表明,顺铂可引起细胞内的ROS水平升高导致细胞凋亡,同时造成细胞内Prx V蛋白质表达水平下降。利用慢病毒载体过量表达Prx V基因后,顺铂诱导的Prx V过量表达型HepG2细胞凋亡率明显低于Mock组,同时促凋亡蛋白cleavage-Caspase-3、Bad、cleavage-PARP表达水平也明显被下调,说明Prx V在顺铂诱导HepG2细胞凋亡过程中具有一定的抑制作用。该研究初步探究了Prx V在顺铂诱导的HepG2肝癌细胞凋亡过程中的调控作用,为肝癌的治疗研究提供了新的思路和治疗靶点。     

利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。     

LRP16影响电离辐射诱导的NF-κB活性

目的:研究LRP16在电离辐射激活核转录因子NF-κB信号转导通路中的作用。方法:在HeLa细胞中,分别运用双萤光素酶分析和Western印迹检测LRP16对κB-Luc报告基因及NF-κB下游靶基因表达的影响。结果:双萤光素酶实验证实LRP16过表达促进电离辐射诱导的κB-Luc活性,而抑制LRP16则降低电离辐射诱导的κB-Luc活性;Western印迹结果显示,LRP16过表达促进电离辐射诱导NF-κB的下游抗凋亡基因XIAP的表达,与之相对应的是,抑制LRP16降低电离辐射诱导NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达。结论:LRP16可以调节电离辐射诱导NF-κB的转录活性,并且调控NF-κB下游抗凋亡基因XIAP的表达,为进一步阐明电离辐射激活NF-κB转录活性的分子机制奠定了基础。     

碘化钾对染铅近曲肾小管上皮细胞XIAP表达及凋亡的影响

目的：研究碘化钾对染铅肾小管上皮细胞（HK-2）XIAP的表达及凋亡的影响,探讨其对抵抗铅导致的近曲肾小管上皮细胞损伤的可能机制。方法：应用细胞组化法检测染铅HK-2细胞及对照组细胞中XIAP的表达;流式细胞术检测其凋亡情况。结果：染铅HK-2细胞中XIAP的表达明显低于对照组,且随着铅浓度的增高而降低,碘化钾能够抑制XIAP的表达的降低;染铅HK-2细胞的凋亡率明显高于对照组,且随着铅浓度的增高而升高（p〈0.05/p〈0.01）,碘化钾能够降低染铅细胞的凋亡率（p〈0.05/p〈0.01）。结论：碘化钾能够上调染铅HK-2细胞中抗凋亡蛋白XIAP的表达,降低凋亡率,在一定程度上降低铅对细胞的损伤。     

大鼠脑缺血再灌注后Smac、XIAP和caspase-9表达及活血通络方的干预作用

目的：探讨大鼠脑缺血再灌注后线粒体通路第二种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物（Smac）、凋亡抑制蛋白（XIAP）和凋亡蛋白酶（caspase）-9的表达变化及活血通络方的干预作用机理。方法：将大鼠随机分成模型组、活血通络组,大脑中动脉栓塞再通法建立脑缺血再灌注模型。大鼠脑缺血再灌注6、12、24和48 h不同时间点进行神经功能评分,用免疫组化法检测Smac、XIAP和caspase-9阳性细胞数。结果：缺血再灌注后6 h模型组神经功能症状积分升高,缺血半暗带皮质内神经元凋亡增多,Smac、XIAP和caspase-9蛋白的表达亦有明显上升,再灌注12 h达高峰（P〈0.05,P〈0.01）,随后出现下降。活血通络方能显著降低神经功能症状积分,减少神经元凋亡,促进XIAP表达,下调Smac和caspase-9表达（P〈0.01,P〈0.05）。结论：脑缺血再灌注后脑组织Smac、XIAP和caspase-9蛋白的表达均明显增加,提示它们可能在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,活血通络方可能通过促进XIAP并抑制Smac、caspase-9表达保护神经元及神经功能。     

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞TSLC1基因甲基化及其表达的影响

目的：检测人宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因甲基化的状况,研究在人宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中TSLC1基因甲基化的变化情况,探讨肿瘤细胞凋亡与抑癌基因甲基化的相关性,并进一步证实天花粉蛋白（TCS）去甲基化作用是否存在普遍性,以促进天花粉蛋白的临床应用。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测人宫颈癌HeLa细胞及其凋亡过程中TSLC1基因甲基化的状况;采用实时定量RT-PCR技术检测TCS处理前、后HeLa细胞TSLC1基因表达的变化。结果：肿瘤抑制基因TSLC1在人宫颈癌HeLa细胞中呈高度甲基化状态,经40μg／mL TCS处理48h后,TSLC1基因甲基化程度明显降低;RT-PCR检测结果显示,TCS处理组HeLa细胞中TSLC1 mRNA的表达量高于未处理组,提示TSLC1基因启动子区CpG岛甲基化是导致其低表达的重要机制。结论：肿瘤抑制基因TSLC1启动子甲基化在人宫颈癌癌变过程中可能是一种重要的分子调控机制;人宫颈癌HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化之间可能存在某些密切的相关性;TCS对肿瘤抑制基因TSLC1有一定的去甲基化作用。     

XIAP及survivin在原发性肝细胞癌组织中的表达及其相关性研究

目的：探讨X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）和survivin在原发性肝细胞癌中的表达及两者的相关性。方法：选取本院收治的60例原发性肝细胞癌患者,应用免疫组织化学染色的方法对肝癌组织及癌旁组织中的XIAP及survivin的表达进行检测。结果：经比较,肝癌组织中XAIP及survivin的阳性率均显著高于癌旁组织,差异有统计学意义。XIAP和survivin的表达强度与肿瘤的大小无关,但随肿瘤的分化程度的降低而升高,且不同分化程度之间差异有统计学意义;XIAP和survivin存在正相关关系。结论：XIAP与Survivin在肿瘤组织中的高表达在促进肿瘤发生、增殖、转移以及耐药,并且能够降低肿瘤的分化程度,增加肝癌的恶性程度。此外,两者可能存在协同作用,但两者的相关性及作用机制仍需进一步探讨。     

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。     

多功能转录因子CTCF结构域的转录活性研究

目的:CTCF是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子。利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中研究CTCF各结构域的转录活性。方法:借用CheckMate哺乳动物双杂交系统的2个质粒pBIND和pG5LUC,将CTCF的N、M、C段及全长编码序列克隆至pBIND质粒的GAL4DNA结合结构域编码序列后的多克隆位点,将表达GAL4DNA结合结构域-CTCF融合蛋白的pBIND重组质粒与由腺病毒晚期主要启动子控制的报告基因质粒pG5LUC共转染HeLa细胞系,检测CTCF各结构域对报告基因表达水平的影响。结果:转染含CTCFN段的质粒可使报告基因的表达量增长至3.5倍以上;转染含CTCF其他片段的质粒对报告基因的表达没有明显的影响。结论:在HeLa细胞中,对启动子具有转录激活活性的主要是CTCF的N段,而M段和C段几乎没有转录激活活性。