RNA干扰在抗乙肝治疗中的应用及其研究进展

据世界卫生组织(WHO)报道,全世界约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(HBV),其中3.5亿人为慢性HBV感染者.我国现有1.3亿乙肝病毒携带者和3 000多万乙肝患者,其中约有20%～40%的患者经过多年慢性炎症的反复发作可发展为肝硬化和肝癌.然而,至今人们仍没有找到一种能够彻底治愈慢性乙肝的特效药物.自从RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术建立以来,人们致力于将其应用于抗病毒药物的研究与开发.研究结果表明,RNAi可有效地抑制乙肝病毒的复制,但靶向目的基因的不同RNA干扰片段所沉默的效率不同.关于将RNAi抗病毒药物应用于人体治疗的安全性和有效性还有待进一步研究,RNAi发生"脱靶"的现象是临床应用的难点之一.     

siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究

以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA。然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用。结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证。     

质粒介导的核衣壳蛋白siRNA干扰A型流感病毒复制的研究

A型流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科流感病毒属,可引起鸟类、多种禽类、人类和低等哺乳动物的严重疾病[1],该病毒基因组为负链单股RNA病毒, 分8个节段,容易引起抗原漂移和抗原变异,现有的疫苗和药物不能有效的控制该病毒感染.     

质粒介导的核衣壳蛋白siRNA干扰A型流感病毒复制的研究

A型流感病毒(Influenzavirus)属于正粘病毒科流感病毒属,可引起鸟类、多种禽类、人类和低等哺乳动物的严重疾病[1],该病毒基因组为负链单股RNA病毒,分8个节段,容易引起抗原漂移和抗原变异,现有的疫苗和药物不能有效的控制该病毒感染。RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)引发的信使RNA(mRNA)序列特异性消减现象,是一种保守的抗病毒机制,已发现于线虫、植物和哺乳动物中[2]。自然发生的RNAi是由一种dsRNA特异的的核酸内切酶Dicer RDE1引发的,它将dsRNA切割成21～23nt的小分子干扰RNA片断(small interferenceRNA,siRNA),siRNA再与某…     

番茄丛矮病毒的分子生物学研究进展

近年来,多种植物RNA病毒载体被广泛地应用于外源基因的表达、植物病毒学和植物病理学基础理论的研究中.番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)的典型成员.TBSV病毒基因组复制、转录和翻译等分子机制的研究取得了巨大的进展,使得利用TBSV构建稳定、高效的表达载体成为可能.     

Evolution and Diversification of RNA Silencing Proteins in Fungi

Comprehensive phylogenetic analyses of fungal Argonaute, Dicer, and RNA-dependent RNA polymerase-like proteins have been performed to gain insights into the diversification of RNA silencing pathways during the evolution of fungi. A wide range of fungi including ascomycetes, basidiomycetyes, and zygomycetes possesses multiple RNA silencing components in the genome, whereas a portion of ascomycete and basidiomycete fungi apparently lacks the whole or most of the components. The number of paralogous silencing proteins in the genome differs considerably among fungal species, suggesting that RNA silencing pathways have diversified significantly during evolution in parallel with developing the complexity of life cycle or in response to environmental conditions. Interestingly, orthologous silencing proteins from different fungal clades are often clustered more closely than paralogous proteins in a fungus, indicating that duplication events occurred before speciation events. Therefore, the origin of multiple RNA silencing pathways seems to be very ancient, likely having occurred prior to the divergence of the major fungal lineages. Electronic Supplementary Material Electronic Supplementary material is available for this article at and accessible for authorised users. [Reviewing Editor: Dr. Rüdiger Cerff]     

Knockdown of Cellular RNA Helicase DDX3 by Short Hairpin RNAs Suppresses HIV-1 Viral Replication Without Inducing Apoptosis

The targeting of a cellular co-factor, rather than the HIV-1-specific RNAs, by small interfering RNAs holds promise as the rapid mutational ability of the HIV-1 genome may obviate the potential clinical use of RNAi against this virus. The DEAD-box RNA helicase DDX3 is an essential Rev co-factor in the CRM1-Rev-RRE complex that promotes the export of unspliced and single-spliced HIV-1 RNAs from the nucleus to cytoplasm. In this report, human DDX3 was targeted by specific short hairpin RNAs, and the down-regulation of cell's endogenous DDX3 suppressed the nuclear export of unspliced HIV-1 RNAs but did not affect the cell viability. We further showed that the knockdown of cellular DDX3 could effectively inhibit the replication of HIV-1. Therefore, the current results suggest that the RNA helicase DDX3 may become a potential target by RNAi for future genetic therapy of HIV/AIDS.     

哺乳动物中RNA干扰沉默基因表达的研究进展

RNA干扰及相关基因沉默导致的代谢通路变化已经彻底改变了人们对基因调控的理解。基因沉默技术已经被用来作为一种研究工具来控制某些细胞基因的表达,特异的si RNA导入不同的细胞需要不同的转染载体才能达到最大的转染效率,并且不会产生较大的细胞毒性。近年来尤其是碳纳米管等新型纳米材料载体的应用拓展了人们对传统脂质体和病毒载体的认识。首先介绍RNA干扰技术及其发展历程,随后对利用几种不同的载体来设计和进行RNA干扰试验进行了比较,最后对最初的脂质体到生物病毒再到高分子纳米材料介导的RNA干扰在疾病的治疗和临床诊断进行了展望。     

中蜂囊状幼虫病毒RdRp基因dsRNA干扰的研究

中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)可以引起中蜂幼虫死亡,给中蜂的养殖造成严重的威胁。其RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是病毒复制中必不可少的中心酶,控制着病毒的复制和翻译过程。本研究以CSBV RdRp基因为靶标,选取两个干扰区域RdRp-1和RdRp-2,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi实验,通过qRT-PCR检测CSBV RdRp基因的表达情况。实验结果显示:干扰片段RdRp-1不能显著下调RdRp基因的转录,而干扰片段RdRp-2可显著性下调RdRp表达并具有剂量依赖性,当添食2μg dsRdRp-2时,在72 h RdRp基因表达下调了85%,CSBV的衣壳蛋白VP1基因下调表达78%,幼虫死亡率降低60%,表明RdRp基因可以作为RNA干扰的靶标用于CSBV防治,本研究为后期在养蜂场进行蜜蜂病毒病的防治奠定了基础。     

RNA干扰抑制癌胚抗原表达对结肠癌细胞增殖的影响

癌胚抗原（CEA）作为肿瘤标志物,在多种恶性肿瘤中高表达.为探索CEA在肿瘤发生发展过程中的生物学作用,本研究以结肠癌细胞株8307为研究对象,应用RNAi技术抑制CEA在8307细胞中的表达,观察其对8307细胞生长的影响.依据siRNA设计原则,设计合成靶向CEA的shRNA并克隆到pSilencer2.1-U6 neo载体中,成功构建了CEA shRNA表达载体,通过脂质体介导转染8307细胞,经G418筛选出抑制CEA表达的稳定细胞.RT-PCR、Western印迹分别检测CEA mRNA及蛋白表达水平,MTT及集落形成实验检测细胞增殖活性.实验结果显示,构建的CEA shRNA表达载体明显抑制CEA mRNA及蛋白水平的表达.MTT实验中,CEA表达下调的8307细胞生长活性降低,与对照组相比,抑制率达39%（P<0.05）,细胞集落形成能力也显著降低（P<0.05）.上述结果初步证明,构建的CEA shRNA表达载体能明显降低CEA的表达,并抑制结肠癌细胞增殖活性.     

Suppression Of Hepatitis C Virus Core Protein By Short Hairpin Rna Expression Vectors In The Core Protein Expression Huh-7 Cells

Short hairpin RNAs (shRNAs) efficiently inhibit gene expression by RNA interference. Here, we report the efficient inhibition by DNA-based vector-derived shRNAs of core protein expression in Huh-7 cells. The shRNAs were designed to target the core region of the hepatitis C virus (HCV) genome. The core region is the most conserved region in the HCV genome, making it an ideal target for shRNAs. We identified an effective site on the core region for suppression of the HCV core protein. The HCV core protein in core protein-expressing Huh-7 cells was downregulated by core protein-shRNA expression vectors (core-shRNA-452, 479, and 503). Our results support the feasibility of using shRNA-based gene therapy to inhibit HCV core protein production.     

RNAi靶向VP2基因抑制中蜂囊状幼虫病毒在中华蜜蜂幼虫体内复制研究

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)是造成中华蜜蜂患病死亡的主要原因之一,目前尚无有效的治疗方法。为了研究靶向中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2基因的siRNA介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用和其对CSBV在中华蜜蜂幼虫体内复制的影响,设计合成针对CSBV VP2基因的特异性siRNA,以100 nM的浓度与pEGFPN1-VP2-CSBV融合表达载体共同转染至293T细胞中,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析siRNA在体外对CSBV VP2基因表达的干扰效果。同时,将siRNA(1μg/μL)和1×10~7拷贝数的CSBV共同饲喂2日龄中华蜜蜂幼虫,检测幼虫体内CSBV拷贝数和幼虫存活率,研究siR-NA对中华蜜蜂幼虫体内CSBV复制的影响。荧光结果显示,在293T细胞中siRNA能抑制CSBV VP2蛋白的表达,并且通过流式细胞仪检测分析发现干扰效果接近40%。幼虫饲喂实验表明,饲喂siRNA组在各时间点幼虫体内CSBV拷贝数均低于CSBV对照组,且在摄入siRNA后感染CSBV的幼虫存活率明显上升,与CSBV组差异极显著(P<0.01)。通过本研究,证明了针对CSBV结构蛋白VP2基因的特异性siRNA能够介导产生RNAi,影响CSBV在中蜂体内的复制,为深入研究CSBV VP2基因的功能和研发抗CSBV生物制剂提供了理论基础。     

RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指外源或内源的双链RNA（dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制及基因表达研究进展

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由21～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。目前对由乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果,而RNA干扰技术的出现为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。本文对RNA干扰抑制HBV复制及基因表达的研究现状、存在问题及应用前景进行了综述。