脱血红素细胞色素c对DMPG膜的插入研究

气－液界面单分子层实验发现鸡心脱血红素细胞色素ｃ对ＤＭＰＧ单分子层表现出很强的插入能力,这种插入能力受亚相溶液离子强度的调节。通过傅里叶变换红外光谱对鸡心脱血红素细胞色素ｃ与ＤＭＰＧ脂质体的作用进行了进一步研究,对磷脂不同区域的红外光谱分析表明鸡心脱血红素细胞色素ｃ不仅与ＤＭＰＧ头部存在静电相互作用而且与其疏水部分也存在相互作用。     

脱血红素细胞色素c与膜结合及插膜时的构象研究

应用特殊的单分子层样品制备技术,分别制备了与中性、酸性磷脂膜结合的和完全插膜的鸡心脱血红素细胞色素c样品,并运用圆二色谱(CD)、表面衰减全反射Fourier变换红外光谱(ATR-FTIR)对膜上蛋白的构象进行了鉴定.研究结果表明,蛋白在与膜结合及插入阶段的构象是不同的,膜界面性质的不同也会对蛋白的构象产生不同的诱导,在酸性磷脂DSPG膜表面,该蛋白是以α螺旋和β折叠混合的构象形式结合;而在中性磷脂DSPC膜表面是以β折叠为主的构象形式结合.插入 DOPG单分子层内时则是 α螺旋为主的构象形式.     

脱血红素细胞色素c插入磷脂单分子层能力的研究

介绍了一种改进的、用于研究膜脂-蛋白相互作用的气-液界面单分子层实验模型及实验装置,并在该实验装置上研究了来自马心和金枪鱼心的线粒体前体蛋白脱血红素细胞色素c与大豆磷脂单分子层的相互作用,实验结果表明这两种前体蛋白对大豆磷脂单分子层都具有较强的亲和性和插膜能力,其临界插膜压力分别为43mN/m、45mN/m.     

脱血红素细胞色素C自发折叠的进一步验证

用胰蛋白酶水解结构聚丙烯酰胺凝胶电泳以及纳秒内源荧光衰减谱分析对鸡心脱血红素细胞色素Ｃ在透析复性过程的自发折叠现象作进一步确定，结果显示随着透析复性时间的增加，鸡心脱血红素细胞色素Ｃ对胰蛋白酶的水解敏感性逐渐下降，内源荧光寿命值增大，与此对应的马心脱血红素细胞色素Ｃ没有发生变化。     

脱血红素细胞色素c自发折叠的进一步验证

用胰蛋白酶水解结合聚丙烯酰胺凝胶电泳以及纳秒内源荧光衰减谱分析对鸡心脱血红素细胞色素ｃ在透析复性过程的自发折叠现象作进一步确定。结果显示随着透析复性时间的增加,鸡心脱血红素细胞色素ｃ对胰蛋白酶的水解敏感性逐渐下降,内源荧光寿命值增大,与此对应的马心脱血红素细胞色素ｃ没有发生变化。     

线粒体、细胞色素c与细胞凋亡

线粒体是细胞的一个独特而重要的细胞器,它为细胞各种生命活动提供能量。许多研究表明,线粒体的作用远比人们了解的复杂和多样。近年来研究发现,线粒体与细胞凋亡密切相关,表现在如下一些方面。１．细胞凋亡早期线粒体跨膜电位（ΔΨｍ）下降自１９９３年以来,Ｋｒｏ...     

去血红素细胞色素c的制备及其结构研究

在酸性条件下用硫酸银断裂马心细胞色素ｃ（以下简称ｃｙｔ．ｃ）的肽链与血红素相连的硫醚键,通过酸性丙酮抽提,硫基乙醇处理及超速离心等步骤纯化得去血红素的ｃｙｔ．ｃ（以下简称Ａｐｏ－ｃｙｔ．ｃ）。Ａｐｏ－ｃｙｔ．ｃ与天然ｃｙｔ．ｃ相比,其酸性电泳迁移率明显降低,紫外－可见光谱在１９０～２２０ｎｍ处吸收上升,荧光光谱的最大发射峰波长产生红移,同时ＣＤ谱中α螺旋的特征峰完全消失,这说明在ｃｙｔ．ｃ去血红素的过程中,蛋白质已由原来的紧密球状结构变成了较为松散、伸展的无规卷曲构象。因此,血红素对ｃｙｔ．ｃ天然构象的维持有着重要作用。     

不同解折叠状态鸡心脱血红素细胞色素c分子的表面性质

脱血红素细胞色素ｃ的构象与其跨膜转运能力是密切相关的。鸡心脱血红素细胞色素ｃ具有较强的自发折叠的能力,在一定条件下可以得到不同解折叠状态的鸡心脱血红素细胞色素ｃ。本文利用疏水层析、与疏水探针１,８—ＡＮＳ的结合以及色氨酸与结合的ＡＮＳ之间的荧光共振能量转移,比较了不同解折叠状态的鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子的表面性质。结果表明,部分折叠的鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子获得了一种高度动态的结构,形成了动态的疏水核心;同时,它也具有较强的凝集倾向。这些性质与鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子较强的自发折叠能力是一致的,为进一步分析鸡心脱血红素细胞色素ｃ分子的构象及其在跨膜转运过程中与脂的相互作用奠定了基础。     

C17S和H18D突变对鸡脱辅基细胞色素c跨线粒体膜输入的影响

体外转录鸡脱辅基细胞色素c(apocytochromec,简称apocyt.c)mRNA ,以之翻译apocyt.c并以3 5 S 甲硫氨酸标记 ,在纯化的鸡心线粒体上对它的跨膜转运与其经血红素加合酶催化转化为细胞色素c的关系进行了研究 .结果表明 ,即使在不利于形成细胞色素c的生化条件下鸡apocyt.c也能有效地输入线粒体 .为进一步证实apocyt.c的跨膜转运过程独立于转化为细胞色素c ,对apocyt.c的血红素结合位点进行基因的定点突变 ( 1 7位 :Cys→Ser;1 8位 :His→Asp) ,然后研究了 2个突变体apocyt.c的跨膜转运 .结果C1 7S和H1 8D都仍能有效地输入线粒体 ,但发现转运初速率已显著变慢     

脱辅基细胞色素c定向于线粒体的转运特异性研究

用分离纯化的完整线粒体和部分细胞器组分,初步研究了脱辅基细胞色素c在细胞内转运的特异性。完整线粒体用差速离心和密度梯度离心的方法,从幼龄鸡心肌组织中获得,对胞内几种细胞器标志酶比活力的测量表明,纯化的线粒体单胺氧化酶活力提高25.6倍,腺苷酸激酶活力提高3.59倍,细胞色素c氧化酶活力提高5.48倍,外膜完整性达90%以上,呼吸控制率大于20。以上数据表明该纯化的线粒体受胞内其它囊泡成分污染少,外膜完整并具有较高的氧化磷酸化偶联效率;在纯化线粒体的同时,得到另两种细胞器组分-内质网和溶酶体囊泡。体外转录翻译的apo.c与上述几个组分的结合实验表明,完整线粒体与apo.c的结合能力明显高于其它组分。     

磷脂酸(PA)-磷脂酰乙醇胺(PE)相互作用有利于脱血红素细胞色素c跨脂质体的运送

细胞色素c的前体 -脱血红素细胞色素c(Apocyt.c)在细胞质中核糖体合成 ,之后跨线粒体膜运送 ,在线粒体内、外膜间隙中经酶催化与血红素Heme结合形成成熟型的细胞色素c定位于线粒体内膜外侧     

蛋白质跨线粒体膜运送的研究进展

线粒体拥有约1000种蛋白质,其中98％以上系由细胞核编码,在细胞质核糖体上以前体形式合成,之后再运至线粒体,经跨膜运送并分选定位于各部分。现对定位于外膜、基质和内膜的蛋白质的运送途径的研究进展作一扼要介绍。脱血红素细胞色素c是细胞色素c的前体,它不含导肽,对其转运的研究概况也作了评述。     

酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析

目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。     

酮古龙酸菌细胞色素c基因的克隆及表达

目的:从酮古龙酸菌SCB329中分离细胞色素c(Cytc)相关基因,在大肠杆菌中进行表达并验证。方法:根据酮古龙酸菌SCB329基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329基因组中扩增cytc基因,酶切后连接pET22b表达载体,转化至大肠杆菌DH5α后提取质粒,经PCR、质粒双酶切及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),并对表达条件进行考察;用Chelating Sepharose珠粒对可溶性的Cytc-His融合蛋白进行纯化;经光谱扫描和血红素染色等方法对表达蛋白定性分析。结果:PCR扩增的cytc基因长513 bp;重组菌在IPTG浓度为0.025 mmol/L的条件下,于28℃诱导10 h后,SDS-PAGE分析可见表达条带,相对分子质量约为18×103;Ni柱亲和层析纯化得到目的蛋白,纯化蛋白经光谱扫描呈现Cytc特征峰,血红素染色呈现阳性结果。结论:从酮古龙酸菌SCB329中分离得到一种cytc基因,并表达纯化了融合蛋白Cytc-His,纯化蛋白呈现Cytc特性,为研究酮古龙酸菌中产酸关键酶的电子传递机制奠定了基础。     

鸡心脱辅基细胞色素c自发折叠的进一步研究

将野生型鸡心脱辅基细胞色素ｃ及其突变体Ｖ９２Ａ的１７位半胱氨酸残基突变为丝氨酸,再将表达纯化的Ｖ９２Ａ／Ｃ１７Ｓ和Ｗ／Ｃ１７Ｓ用荧光探针ＩＡＥＤＡＮＳ标记．通过测量ＡＥＤＡＮＳ－Ｃｙｓ－１４的荧光光谱、荧光寿命以及ＡＥＤＡＮＳ与Ｔｒｐ－５９之间的荧光共振能量转移效率、比较了Ｖ９２Ａ与野生型鸡心脱辅基细胞色素ｃ因折叠状态不同引起的Ｎ端构象状态及肽链间相互作用的差异．结果显示Ａｐｏ．ｃ无论在低盐浓度下的无规卷曲状态还是高盐浓度下的融球态,Ｖ９２Ａ都较野生型处于更松散的折叠状态,此外,在鸡心脱辅基细胞色素ｃ的自发折叠中Ｎ端肽段并不起主要作用     

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。     

细胞色素c在氨基酸及二肽修饰金电极上的电化学反应

系统地研究了细胞色素ｃ在多种氨基酸和多肽修饰电极上的电化学反应。并对影响加速细胞色素ｃ电化学反应的因素进行了讨论。     

缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用

为了探讨线粒体ATP敏感钾通道（mitochondrial ATP-sensitive K^＋channel,mito KATP）和线粒体膜电位（△ψm）在细胞缺氧信号转导中的作用以及对缺氧肺动脉平滑肌细胞中细胞色素C在细胞内的分布及细胞增殖的影响,本实验将人肺动脉平滑肌细胞进行常氧或24h缺氧培养,并将标本分为六组：（1）对照组;（2）mito KATP,开放剂diazoxide组;（3）mito KATP阻断剂5-HD组;（4）24h缺氧组;（5）24h缺氧＋diazoxide组;（6）24h缺氧＋5-HD组。利用激光共聚焦显微镜成像法检测△、ψm;线粒体／胞浆成分分离试剂盒（Bio Vision）分离线粒体和胞浆成分后,Western blot检测两者细胞色素C;Western blot检测细胞中caspase-9的蛋白表达量;MTT法及PI染色后流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果显示：（1）diazoxide作用24h后,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;而5-HD作用24h与正常对照组比较,上述指标无明显变化（P〉0．05）。（2）缺氧24h组,结果与diazoxide组相似,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;24h缺氧＋diazoxide组与缺氧组相比较,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少（P〈0．05）;而24h缺氧＋5-HD组与缺氧组比较,R-123荧光明显降低,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,caspase-9的蛋白表达显著增加,细胞增殖明显减少、凋亡增多（P〈0．05）。上述实验结果提示,缺氧可以引起mito KATP,的开放以及△ψm的去极化,并进而抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响肺动脉高压的发生、发展。     

人细胞色素c基因在大肠杆菌中的克隆和表达及活性测定

通过PCR方法 ,从人胎儿心肌基因组DNA中得到precytc基因 (有 1个内含子 ) ,剔除内含子后 ,得到细胞色素c基因的编码序列 .测序结果表明 ,该基因与GenBank中报道的人细胞色素c基因核苷酸顺序完全一致 .将其插入原核表达载体pET3a的NdeⅠ和HindⅢ位点之间构建pET3a cytc重组质粒 ,并成功转化入E .coliBL2 1(DE3)中 .经IPTG诱导表达后 ,15 %SDS PAGE分析 ,可观察到1条与细胞色素c蛋白分子量相符的电泳条带 .Western印迹结果显示 ,该条带与小鼠抗人cytc单克隆抗体IgG2b发生特异反应 ,证实为人细胞色素c的前体蛋白 .体外使血红素与该前体蛋白结合生成完整的人细胞色素c蛋白 ,其耗氧量在不同浓度具有与反应时间的线性关系 ,为研究人细胞色素c结构和功能关系奠定了基础     

囊素与杂交瘤细胞的结合及结合肽的鉴定

【目的】囊素(BS)是禽类和哺乳动物中具有重要免疫调节功能的多肽,能有效促进杂交瘤细胞抗体的分泌,为探讨杂交瘤细胞是否有BS受体分子的表达。【方法和结果】本研究采用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪分析的方法,检测BS与杂交瘤细胞的结合特性。实验结果证实BS与杂交瘤细胞的结合具有特异性、趋饱和性和可逆性。为进一步分析BS与杂交瘤细胞的结合位点,实验中以BS分子作为靶标,对噬菌体随机12肽库进行了4轮亲和筛选,ELISA和竞争抑制试验显示2个噬菌体克隆能特异性与BS结合。对阳性噬菌体克隆进行序列测定分析表明,其插入的12肽分别为:ACTKHLCLLQPL、MSCNDTLCLLPN,保守序列为LCLL。体外实验表明,2个人工合成的12均都能在一定程度上抑制BS与杂交瘤细胞的特异性结合。【结论】本研究表明杂交瘤细胞具有BS结合的受体,这为进一步研究BS促杂交瘤细胞抗体分泌的信号传导通路奠定了基础。