昆虫蜕皮激素受体及其类似物的杀虫机制研究进展

昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的严格调控。蜕皮激素作用靶标由蜕皮激素受体（ecdysteroid receptor, EcR）和超气门蛋白（ultraspiracle protein, USP）组成,蜕皮激素与EcR/USP作用启动蜕皮级联反应过程。昆虫EcR具有种类或类群的特异性,研究其结构、功能和调控机理在开发环境友好型新药剂和基因调控开关等方面具有重要指导作用。该文介绍了昆虫EcR的结构和功能特点,蜕皮激素及其类似物与EcR/USP的分子作用方式,以及基于EcR/USP的新杀虫剂创制和基因调控开关设计等方面的重要进展。     

昆虫蜕皮激素信号转导途径研究进展

蜕皮与变态是全变态昆虫典型的发育特征。调控昆虫蜕皮与变态的激素主要有蜕皮激素和保幼激素。目前已经阐明了蜕皮激素的核受体EcR及部分核信号转导途径,但蜕皮激素是否存在膜受体及膜信号转导途径研究很少。研究证明,蜕皮激素存在细胞质中的信号转导分子和途径,蜕皮激素通过NTF2和Ran调控EcR入核启动基因转录。蜕皮激素使细胞质中的热休克蛋白Hsc70部分入核与USP结合启动基因转录。蜕皮激素通过蛋白激酶PKC使伴侣蛋白calponin磷酸化,参与蜕皮激素信号途径的基因转录。这些研究结果说明蜕皮激素除了有核受体和核受体信号转导途径外,还存在细胞膜受体和细胞膜信号转导途径。     

棉铃虫章鱼胺受体2基因的分子鉴定

【目的】为了探讨章鱼胺受体2基因(Octopamine receptor 2,OA2B2)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)体内表达谱及激素对其调控作用,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用,开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。【方法】本实验采用QRT-PCR技术、激素处理、RNAi介导的蜕皮激素相关核受体沉默等方法对Ha OA2B2受体基因在棉铃虫不同发育阶段及组织中的表达谱与激素调控进行探究。【结果】生物信息学分析表明,Ha OA2B2受体基因编码框长度1 191 bp,编码396个氨基酸。Ha OA2B2受体基因氨基酸序列与家蚕Bombyx mori一致性高达89%。Ha OA2B2受体基因在棉铃虫各时期均有表达,尤其在5龄第3天转录水平达到最高;Ha OA2B2受体基因在棉铃虫幼虫头部表达量最高。蜕皮激素可促进Ha OA2B2受体基因的表达。【结论】分析了该基因的序列特征和表达谱,蜕皮激素对其表达量的影响,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用以及开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。     

IL-1β对正常和自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞iNOS基因转录调控因子的影响

用ＩＬ－１β处理体外培养的ＳＨＲ和ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）,比较两种大鼠ｉＮＯＳ基因表达活性的变化,Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果表明,ＶＳＭＣ受ＩＬ－１β刺激后,两种细胞的ｉＮＯＳ基因均表现出极高的转录活性,并且ＳＨＲ的ｉＮＯＳｍＲＮＡ水平高于ＷＫＹ大鼠．以大鼠ｉＮＯＳ基因转录调控区上游６００ｂｐ（－１０３７～－４３８）和下游５００ｂｐ（－４３７～４６）ＤＮＡ片段为探针,与ＶＳＭＣ核蛋白孵育后,进行凝胶电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）,结果显示,两种大鼠的ＶＳＭＣ被ＩＬ－１β处理后,其核蛋白可分别与转录调控区上游或下游序列结合形成一条电泳滞后带．但是,转录调控区上游序列和下游序列与核蛋白形成的复合物具有明显不同的电泳迁移率．与ＷＫＹ大鼠相比,ＳＨＲ的ＶＳＭＣ核蛋白与ＤＮＡ结合活性较高．提示ＳＨＲ的ＶＳＭＣｉＮＯＳ基因及其转录调控因子对ＩＬ－１β的反应与ＷＫＹ大鼠明显不同．     

昆虫变态的激素与基因调控

昆虫变态是一个有趣而复杂的生物学现象,有不完全变态和完全变态。昆虫通过变态获得飞翔与生殖能力,扩大了生活范围,增强了适应能力。昆虫变态主要由咽侧体分泌的保幼激素和前胸腺分泌的蜕皮激素协同调控,众多基因参与。本文综合近几年的研究进展,重点介绍昆虫变态过程中保幼激素与蜕皮激素通过级联反应基因和microRNA调控的机制,以及保幼激素和蜕皮激素的合成调节机制。     

棉铃虫Cathepsin L参与细胞免疫并受蜕皮激素调控

半胱氨酸蛋白酶参与昆虫的许多生理过程,但是其调控机制还不完全清楚,该文利用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)、免疫组织化学、基因干扰(RNAi)等方法对棉铃虫组织蛋白酶L基因(HacatL)进行了系统研究。结果表明, HacatL在棉铃虫血细胞中的浆血细胞和颗粒细胞中大量表达,在蜕皮和变态时期表达量上升。细菌免疫刺激能明显诱导HacatL的表达上调;在幼虫体内将HacatL基因沉默后能明显降低血细胞的伸展性和对细菌的清除能力。蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)能通过其受体(ecdysone receptor, EcR)及配体蛋白(ultraspiracle, USP)诱导HacatL的表达。这些结果说明HacatL基因受到蜕皮激素信号转导途径调控并参与昆虫细胞免疫反应。该研究结果有助于人们理解蜕皮激素调控昆虫细胞免疫的机制,同时也可为高等动物激素调控免疫反应的研究提供新的思路。     

家蚕P450基因CYP18A1的克隆、序列分析及转录活性

蜕皮激素对昆虫生长、发育和繁殖有重要调控作用,尤其对蜕皮和变态过程。利用GenBank上登录的蜕皮激素C₂₆羟基化酶候选基因CYP18A1的氨基酸序列对家蚕Bombyx mori全基因组数据库进行BLASTP比对,发现了家蚕直向同源基因(ortholog),其完全编码序列经RT-PCR检测和克隆、测序验证后,再以此为信息探针检索家蚕表达序列标签(expressed sequence tags,EST)数据库进行拼接延伸,获得了一条包括5′非翻译区在内的长度为1 737 bp的cDNA序列,验证结果也表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为EF421988,P450命名委员会将其命名为CYP18A1)。该基因的开放阅读框为1 623 bp,编码541个氨基酸,含有包括P450s特征结构域在内的所有昆虫P450基因的5个保守结构域,其推定的分子量为61.67 kD,等电点为 8.54。将该基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有6个外显子,5个内含子,外显子／内含子边界符合经典的GT-AG规则。同源性分析也发现家蚕CYP18A1与其他昆虫的直向同源基因具有较高相似性。用RT-PCR方法对家蚕主要发育变态时期与组织进行检测,显示出该基因的转录表达不仅具有时空特异性,而且在表达时期上与已报道的蚕体内蜕皮激素含量变化有紧密的一致性。该研究进一步证实了CYP18A1基因与昆虫体内蜕皮激素代谢平衡相关联。     

三疣梭子蟹Spook基因克隆及其表达分析

甲壳动物蜕皮激素(Ecdysteroids)主要在Y器官(YO)中合成与分泌,参与调控蜕皮、繁殖等多项生理活动。Spook基因编码的细胞色素P450(CYP)307a1是蜕皮激素合成通路早期的关键酶。为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹Spook基因的全长c DNA序列(GenBank登录号:KM030021)。该序列全长为2 200 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码520个氨基酸;比对分析显示该氨基酸序列含helix-C、helix-K、helix-I、PERF、heme-binding 5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现推导的三疣梭子蟹Spook蛋白与其他物种Spook聚为一支,而其他Halloween基因则分别聚为一支,表明推导的氨基酸确实是三疣梭子蟹Spook的蛋白序列。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了其在不同组织中的表达情况,结果显示Spook基因主要在三疣梭子蟹的YO中表达。在三疣梭子蟹的蜕皮周期中,Spook基因的表达水平自蜕皮后期(A、B期)逐渐上升,并在蜕皮间期(C期)上升至最大,随后在蜕皮前期逐渐下降至D_3、D_4亚期最低。研究结果表明Spook基因可能参与调控三疣梭子蟹的蜕皮过程。     

大鼠iNOS基因上游调控区在转录激活中的作用

为了探讨大鼠ｉＮＯＳ基因上游调控区不同部位在对细胞因子诱导应答中所起的作用,将调控区不同部位插入ｐＳＶ０－ＣＡＴ报告基因载体,转染体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）,经ＩＬ－１β诱导后,采用氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）活性测定和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交,检查了调控区各部位在ＩＬ－１β诱导ｃａｔ表达中所起的作用．结果表明,被转染的细胞在未经ＩＬ－１β刺激时,各种调控区序列启动ｃａｔ表达的活性均很低．在ＩＬ－１β作用下,调控区远端序列（－１０３７～－４３８）、近端序列（－４３７～＋４６）和全长序列（－１０３７～＋４６）均能独立激活ｃａｔ表达,其中以全长序列的作用最强,表明ｉＮＯＳ基因表达调控区远端和近端序列均具有启动子和增强子样功能．同时证实,远端序列和近端序列单独启动ｃａｔ表达的活性分别为全长序列的９１．３％和６７．１％,揭示大鼠ｉＮＯＳ基因调控区远端序列在介导ＩＬ－１β的应答反应中发挥更重要作用．     

蜕皮激素和IIS-TORC1信号的分子互作

蜕皮激素信号主导调控昆虫的蜕皮和变态,决定昆虫的发育时间;IIS-TORC1信号整合生长因子、激素、营养和能量信号,决定昆虫的生长速率。蜕皮激素和IIS-TORC1信号之间发生3种分子互作:(1)IIS-TORC1信号促进前胸腺和卵巢合成蜕皮激素前体。(2)在蜕皮和变态期间,蜕皮激素抑制脂肪体细胞内IIS-TORC1信号、Myc的转录、细胞生长及其内分泌功能,导致脑神经分泌细胞分泌胰岛素样肽的功能减弱,从而降低昆虫全身性的IIS-TORC1信号。(3)在幼虫摄食期间,胰岛素信号抑制FOXO的转录活性,降低了蜕皮激素受体EcR的转录共激活因子DOR编码基因的转录水平,从而阻碍了蜕皮激素信号传导。蜕皮激素信号和IIS-TORC1信号协同调控发育时间和生长速率共同决定昆虫的个体大小。     

对抗HIV的人工合成小蛋白

科学家发现 ,有一个基因所产生的一个小蛋白能阻断感染细胞中的ＨＩＶ ,而该基因在人类基因组中是无用的 ,实为假基因 .该假基因是与ＡＩＤＳ作战斗的一个新武器 .除此以外 ,其引起人们推测为何ＨＩＶ感染能杀伤人 ,而不会杀伤非人类的灵长类 .数年前研究者发现 ,恒河猴有一个基因编码一个新的微生物杀伤蛋白 .最近研究者指出 ,人有一个与上述恒河猴基因紧密相关的基因 ,该基因在骨髓中有活性 .而人类的这个基因含有一个突变 ,该突变阻止细胞完整地制造出它所编码的蛋白质 .研究者推断了该假基因不发生突变时所编码的蛋白质的氨基酸序列 .他…     

两种AFP阳性肝癌细胞专一基因表达调控序列的构建

构建了由人胰蛋白酶抑制基因的增强子和大鼠ａｆｐ基因启动子与沉默子组成的杂合基因表达调控序列;还构建了１．２ｋｂ的由大鼠ａｆｐ基因增强Ⅲ和ｒＰＳ组成的调控序列。将报告基因－氯霉素乙酰转移酶基因置于这些序列控制之下,构建成ＣＡＴ表达载体ＡＴｒＰＳ－ｐＣＡＴ和ｒＡＦＰ－ｐＣＡＴ。     

表面活性物质相关蛋白表达的调控研究进展

特异性的肺表面活性物质相关蛋白（ＳＰ）包括亲水性的ＳＰ－Ａ、ＳＰ－Ｄ和疏水性的ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－Ｃ．它们的表达与合成受众多生理、病理因素影响。本文综述了该领域的研究进展。１．ＳＰ表达的组织细胞特异性调控：只有肺内某些细胞（肺泡Ⅱ型细胞、Ｃｌａｒａ细胞等）能合成分泌ＳＰ,这可能是由ＳＰ基因中特定序列决定的,如ＳＰ－Ｂ基因的细胞特异性表达的调控成分。２．ＳＰ表达的发育期调控：ＳＰ基因属发育控制基因家族。在人类妊娠前３ｍｏｎ胎肺中,ＳＰ基本不表达：妊娠１５－１８ｗｋ时,气管、支气管上皮细胞即可见ＳＰ－Ｂ、ＳＰ－ＣｍＲＮＡｓ和表达蛋白,它们可能比ＳＰ－Ａ出现早：妊娠１９－２０ｗｋ时可见ＳＰ－ＡｍＲＮＡ和表达蛋白,胎肺组织在体外无激素条件下培养可很快诱导ＳＰ表达,在妊娠后３ｍｏｎ内,各ＳＰｍＲＮＡｓ及其表达蛋白水平与磷脂水平平行升高,也与ＳＰ降低表面张力的特性逐渐增强相关,羊水中可检出这些蛋白,板层体的出现与ＳＰ－Ｂ的表达密切相关,而比ＳＰ－Ａ的表达早,胎肺发育过程中ＳＰｍＲＮＡｓ增加至少部分是由于其基因转录率升高,可能同时也与翻译增加有关。３．糖皮质激素对ＳＰ表达的调控：糖皮质激素对ＳＰ－Ａ表达的调控极复杂,且与剂量     

本期重点推介

<正>家蚕Bombyx mori是重要的经济昆虫,也是重要的鳞翅目模式昆虫,研究家蚕中转录因子及其调控元件,可为阐明家蚕功能基因的调控机制、开发特异基因启动子奠定基础,进而能为家蚕生物反应器和鳞翅目害虫防治等提供有价值的参考。西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室顾健健和林英等在已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2E),通过基因克隆技术构建细胞转染载体,通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子     

蜕皮激素诱导MIIP基因的表达对肝癌细胞增殖迁移的影响

目的:探讨蜕皮激素诱导迁移侵袭抑制蛋白基因(migration and invasion inhibitory protein,MIIP)基因的表达对肝癌细胞SK-Hep-1增殖和迁移能力的影响。方法:采用PCR扩增MIIP基因,连入T载体测序正确后,插入到蜕皮激素可诱导真核表达载体pIND中。将pIND-MIIP和含蜕皮激素受体基因的表达载体pVgRXR以脂质体转染法转染到SK-Hep-1中,经G418和Zeocin双抗生素筛选获得稳定转染细胞株。蜕皮激素Ponasterone A诱导后,采用Western blot检测MIIP表达,CCK-8实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移。结果:蜕皮激素诱导MIIP表达上调后,SK-Hep-1细胞的增殖能力显著下降(P0.05),细胞的迁移能力明显减弱。结论:建立了MIIP基因可诱导表达系统,证实在肝癌细胞SK-Hep-1中MIIP过表达可抑制细胞的增殖及迁移能力。     

适体核酶型人工核糖开关的设计

适体核酶型核糖开关是近年出现的一种人工基因调控开关。最常见的适体核酶由锤头状核酶和适体组成,结构清晰,易于设计。作为一种顺式作用元件,适体核酶型核糖开关在特异性配体的作用下,无需蛋白质辅助,即可通过调节自身裂解反应,调控mRNA的翻译,可应用于多种细胞的基因调控。目前适体核酶型核糖开关的设计,主要是通过合理组装核酶与适体元件,整合到mRNA后再进行功能筛选。该基因调控开关调节幅度大、响应迅速、调控方式简洁,有可能应用于体内传感器、基因治疗、生物处理器等多个领域。     

抑制肺癌及乳癌的基因

许多基因编码抑制细胞生长的蛋白质 ,这些基因中的某些基因抑制肿瘤生长 .以前发现ＢＲＣＡ1基因抑制乳癌生长 ,现发现基因ＲＡＳＳＦ1Ａ也是这种基因 .在 2 0 0 1年 5月 2日的ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ上报道的一项研究确认 ,许多肺癌与乳癌缺乏有功能的ＲＡＳＳＦ1Ａ .研究者发现 ,将恢复ＲＡＳＳＦ1Ａ功能的人癌细胞移植到小鼠体内 ,可防止小鼠发生肿瘤 .研究者用外科手术从肺癌和乳癌病人身上取得癌细胞来创建可在实验室生长的细胞系 .从小细胞肺癌病人取得的 32个细胞系中的ＲＡＳＳＦ1…     

用于细胞水平家蚕转录调控元件研究的简单基础启动子的构建

【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2 element, BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28 bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。     

本期重点推介

正CRISPR/Cas9是一种RNA引导的基因组靶向编辑技术,可用于基因敲除、基因修复和基因敲入等操作。组蛋白甲基化修饰属于表观调控,参与调控基因的转录表达,在多种信号通路调节中具有重要作用。为了进一步揭示组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20E)信号传导的调控机理,华南师范大学生命科学学院张文豪和李康等将组蛋白甲基转移酶的sg RNA序列插入到牛津大学实验室构建的敲除载体p Ac-sg RNA-Cas9骨架中,以修饰H3K4甲基化的Trr正调控20E对Br-C的转录诱导为阳性对照,利用q RTPCR和Western blot检测在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中利用该系统敲除靶基因的有效性,并检测敲除不同的组蛋白甲基转移酶基因对20E诱导20E应答元件(Ec RE)活性的影响(pp. 549-557)。     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。