基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源北大核心CSCD

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。     

微生物来源α-L-鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))是一种水解酶,分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族,其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的(α/α)6桶状结构,它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基,在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用,主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。     

基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。     

鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数K_max和V_max分别为0.35 mmol/L和4.2μmol/(mg·min)(R²=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。     

人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp，编码蛋白质分子质量为83 kD，等电点5.58，其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主，整体表现出亲水性，其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明，该酶被分类至亚家族Ⅱ，其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸，催化残基高度保守。为明确其酶学性质，以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside，pNPR）为底物，通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量，得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃，最适pH为6.5，且在30～46℃下保温30 min，不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力，首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明，该酶能普遍耐受1%的有机溶剂，甚至1%～ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇，有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时，仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1，HFM-Rha78的KM较大，为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1，催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明，37℃条件下，随着酶浓度和水解时间增加，芦丁转化率增大。反应10 h时，芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件，并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。     

α-L-鼠李糖苷酶特性简述及影响酶活的因素

α-L-鼠李糖苷酶是一个非常重要的工业酶,广泛分布于各种生物中.不同来源的α-L-鼠李糖苷酶具有多样性.细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH接近中性或偏碱性,而真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH在酸性范围.除此之外,不同来源的α-L-鼠李糖苷酶在最适温度、热稳定性和底物特异性等方面也不尽相同,酶学性质的差异,决定...     

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。     

黑曲霉α-鼠李糖苷酶

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)能特异性地水解许多糖苷类物质,如柚皮苷(Naringin)、芦丁(Rutin)、橙皮苷(Hesperidin)等的末端α-L-鼠李糖基可用于去除柑桔类果汁的苦味、消除桔子汁的橙皮苷结晶、生物转化生产L-鼠李糖、切除糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖以及改善酿造食品的风味等[1?3]。国     

木麻黄凋落物化学成分及其生物活性的研究

利用多种柱色谱和高效液相色谱相结合的方法从木麻黄(Casuarina equisetifolia)凋落物的乙酸乙酯提取物中分离得到7个单体化合物,通过波谱分析结合理化性质鉴定化合物结构分别为:3β-(p-hydroxy-trans-cinnamoyloxy)olean-12-en-28-oicacid(1),3-O-(E)-coumaroylerythrodiol(2),casuarmondtol(3),alnusdiol(4),山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(5),4″-反-香豆酰基-山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(6),山柰酚(7),其中化合物3、4、6和7为首次从该植物中分离得到。分别采用MTT法、Ellman法和PNPG法对单体化合物的体外细胞毒活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性进行测试,测试结果表明,化合物1和6具有细胞毒活性,化合物1~4和6具有乙酰胆碱酯酶抑制活性,化合物1和3~5具有α-糖苷酶抑制活性。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能     

酶法提取铁皮石斛多糖工艺优化及对挥发性成分的影响研究

铁皮石斛具有重要的药用价值,但其资源有限,因此对其充分开发和利用具有重要的意义。本文利用α-L-鼠李糖苷酶辅助提取铁皮石斛多糖,通过对酶解温度、酶解时间及加酶量三个因素进行优化,提高铁皮石斛多糖提取率;结果显示,在酶解温度为40℃、酶解时间为1 h、加酶量为2.5%时,多糖提取率为38.4%,而不加酶处理多糖提取率仅为21.7%,酶法处理大大增加了铁皮石斛的多糖提取率。同时,运用顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱联用仪(HS-SPME-GC-MS)分析比较α-L-鼠李糖苷酶对铁皮石斛挥发性成分的影响;GC-MS分析表明,铁皮石斛加酶处理前后共发现31种挥发性成分,主要成分均为己醛、1-辛烯-3-醇、异薄荷醇和3-辛烯-2-酮,并且醛类化合物在加酶处理前后的样品中相对含量均最高,且加酶处理后产生6种新的挥发性成分。该研究结果表明α-L-鼠李糖苷酶的使用可显著增加对铁皮石斛多糖提取率,并为铁皮石斛挥发性成分的研究和开发利用提供一定的参考依据。     

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因,以pET20b为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为90～95℃和pH 5.0～5.5,在pH 4.2～8.2之间酶活力稳定,95℃的半衰期为4h;SDSPAGE测得酶的分子量为56.57 kD,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷（pNPAF）有专一性水解作用,其动力学参数Km值为018mmol/L, Vmax为139μmol/min·mg。     

黑曲霉α-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株.用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理,用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%.对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL.用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性.     

黑曲霉a-鼠李糖苷酶高产菌株的选育

本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株。用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理, 用透明圈法初筛出的菌株中, 产量提高40%以上的突变菌株占11%; 用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226, 摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL, 比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验, 发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株, 不仅具有较高的筛选效率, 还具有良好的准确性。     

叶下珠中黄酮类化学成分及其生物活性

利用色谱分离方法与现代波谱分析技术,对叶下珠乙酸乙酯提取物的化学成分进行了系统的研究。从中分离鉴定了14个黄酮类化合物,分别为槲皮素-3-(4"-O-乙酰基)-O-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(1)、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(3)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(4)、芸香甙(5)、槲皮素(6)、山柰酚(7)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)、木犀草素(9)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(10)、蒙花苷(11)、山柰酚-3-O-β-芸香糖苷(12)、柚皮苷(13)、橙皮苷(14)。除5~7外的所有化合物均从该植物中首次分离。对分离所得的化合物进行了体外细胞毒和抗氧化活性测试,结果显示化合物6、9和10表现出一定的细胞毒活性,所有化合物均具有不同程度的抗氧化活性。     

嗜热木糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及性质研究

为获得具有高热稳定性的木糖异构酶,运用基因工程技术,从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB8中克隆到嗜热木糖异构酶基因xylA。测序结果表明,该基因与GenBank数据库中相比271位的碱基A突变为G,导致氨基酸序列中N91D突变。将该基因克隆到载体pET22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中进行高效表达。通过热变性和强阴离子交换两步对该酶进行纯化,并对酶学性质进行了研究。结果表明,该酶最适温度为80 °C,最适pH为8.0,80 °C下半衰期为225 min。在60 °C,pH 7.5该酶的Km为15.20 mmol·L-1,Vmax为69.54 μmol·min-1,kcat为50.62 s-1,kcat/Km为3.33 L·s-1·mmol -1。研究结果为嗜热木糖异构酶的进一步工业应用奠定了基础。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种     

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280),将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%(V/V)时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5～9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。