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梁跃斌李彬春李艳琴 《中国生物化学与分子生物学报》2017,(1):66-72
α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。 相似文献
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《中国生物化学与分子生物学报》2017,(1)
α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。 相似文献
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【背景】前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数Kmax和Vmax分别为0.35 mmol/L和4.2μmol/(mg·min)(R2=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。 相似文献
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HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp,编码蛋白质分子质量为83 kD,等电点5.58,其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主,整体表现出亲水性,其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明,该酶被分类至亚家族Ⅱ,其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸,催化残基高度保守。为明确其酶学性质,以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)为底物,通过紫外 可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量,得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃,最适pH为6.5,且在30~46℃下保温30 min,不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力,首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明,该酶能普遍耐受1%的有机溶剂,甚至1%~ 5%的异丙醇和1%的β 巯基乙醇,有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时,仍能保持79%的酶活性。HFM Rha78对底物pNPR的Vmax为129.9 μmol min-1 mg-1,HFM-Rha78的KM较大,为26.0 mmol L-1。转换数kcat为185.1 s-1,催化效率kcat/KM为7.1×103 s-1 mol-1 L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明,37℃条件下,随着酶浓度和水解时间增加,芦丁转化率增大。反应10 h时,芦丁转化率达41.8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件,并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。 相似文献
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α-L-鼠李糖苷酶是一个非常重要的工业酶,广泛分布于各种生物中.不同来源的α-L-鼠李糖苷酶具有多样性.细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH接近中性或偏碱性,而真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH在酸性范围.除此之外,不同来源的α-L-鼠李糖苷酶在最适温度、热稳定性和底物特异性等方面也不尽相同,酶学性质的差异,决定... 相似文献
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从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。 相似文献
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α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC 3.2.1.40)能特异性地水解许多糖苷类物质,如柚皮苷(Naringin)、芦丁(Rutin)、橙皮苷(Hesperidin)等的末端α-L-鼠李糖基可用于去除柑桔类果汁的苦味、消除桔子汁的橙皮苷结晶、生物转化生产L-鼠李糖、切除糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖以及改善酿造食品的风味等[1?3]。国 相似文献
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利用多种柱色谱和高效液相色谱相结合的方法从木麻黄(Casuarina equisetifolia)凋落物的乙酸乙酯提取物中分离得到7个单体化合物,通过波谱分析结合理化性质鉴定化合物结构分别为:3β-(p-hydroxy-trans-cinnamoyloxy)olean-12-en-28-oicacid(1),3-O-(E)-coumaroylerythrodiol(2),casuarmondtol(3),alnusdiol(4),山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(5),4″-反-香豆酰基-山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(6),山柰酚(7),其中化合物3、4、6和7为首次从该植物中分离得到。分别采用MTT法、Ellman法和PNPG法对单体化合物的体外细胞毒活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性进行测试,测试结果表明,化合物1和6具有细胞毒活性,化合物1~4和6具有乙酰胆碱酯酶抑制活性,化合物1和3~5具有α-糖苷酶抑制活性。 相似文献
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戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2~ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2~ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能 相似文献
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铁皮石斛具有重要的药用价值,但其资源有限,因此对其充分开发和利用具有重要的意义。本文利用α-L-鼠李糖苷酶辅助提取铁皮石斛多糖,通过对酶解温度、酶解时间及加酶量三个因素进行优化,提高铁皮石斛多糖提取率;结果显示,在酶解温度为40℃、酶解时间为1 h、加酶量为2.5%时,多糖提取率为38.4%,而不加酶处理多糖提取率仅为21.7%,酶法处理大大增加了铁皮石斛的多糖提取率。同时,运用顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱联用仪(HS-SPME-GC-MS)分析比较α-L-鼠李糖苷酶对铁皮石斛挥发性成分的影响;GC-MS分析表明,铁皮石斛加酶处理前后共发现31种挥发性成分,主要成分均为己醛、1-辛烯-3-醇、异薄荷醇和3-辛烯-2-酮,并且醛类化合物在加酶处理前后的样品中相对含量均最高,且加酶处理后产生6种新的挥发性成分。该研究结果表明α-L-鼠李糖苷酶的使用可显著增加对铁皮石斛多糖提取率,并为铁皮石斛挥发性成分的研究和开发利用提供一定的参考依据。 相似文献
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极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究 总被引:2,自引:0,他引:2
采用PCR从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因,以pET20b为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为90~95℃和pH 5.0~5.5,在pH 4.2~8.2之间酶活力稳定,95℃的半衰期为4h;SDSPAGE测得酶的分子量为56.57 kD,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(pNPAF)有专一性水解作用,其动力学参数Km值为018mmol/L, Vmax为139μmol/min·mg。 相似文献
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黑曲霉α-鼠李糖苷酶高产菌株的选育 总被引:1,自引:0,他引:1
本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株.用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理,用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%.对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL.用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性. 相似文献
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黑曲霉a-鼠李糖苷酶高产菌株的选育 总被引:1,自引:0,他引:1
本文首次报道利用Davis方法制备的透明圈法筛选α-鼠李糖苷酶高产菌株。用甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉孢子进行诱变处理, 用透明圈法初筛出的菌株中, 产量提高40%以上的突变菌株占11%; 用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛α-鼠李糖苷酶高产突变株T-226, 摇瓶培养α-鼠李糖苷酶活达373.4 U/mL, 比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验, 发酵84 h测得α-鼠李糖苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产α-鼠李糖苷酶的高产菌株, 不仅具有较高的筛选效率, 还具有良好的准确性。 相似文献
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《天然产物研究与开发》2017,(12)
利用色谱分离方法与现代波谱分析技术,对叶下珠乙酸乙酯提取物的化学成分进行了系统的研究。从中分离鉴定了14个黄酮类化合物,分别为槲皮素-3-(4"-O-乙酰基)-O-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(1)、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(3)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(4)、芸香甙(5)、槲皮素(6)、山柰酚(7)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8)、木犀草素(9)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(10)、蒙花苷(11)、山柰酚-3-O-β-芸香糖苷(12)、柚皮苷(13)、橙皮苷(14)。除5~7外的所有化合物均从该植物中首次分离。对分离所得的化合物进行了体外细胞毒和抗氧化活性测试,结果显示化合物6、9和10表现出一定的细胞毒活性,所有化合物均具有不同程度的抗氧化活性。 相似文献
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为获得具有高热稳定性的木糖异构酶,运用基因工程技术,从嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB8中克隆到嗜热木糖异构酶基因xylA。测序结果表明,该基因与GenBank数据库中相比271位的碱基A突变为G,导致氨基酸序列中N91D突变。将该基因克隆到载体pET22b(+),并在E. coli BL21(DE3)中进行高效表达。通过热变性和强阴离子交换两步对该酶进行纯化,并对酶学性质进行了研究。结果表明,该酶最适温度为80 °C,最适pH为8.0,80 °C下半衰期为225 min。在60 °C,pH 7.5该酶的Km为15.20 mmol·L-1,Vmax为69.54 μmol·min-1,kcat为50.62 s-1,kcat/Km为3.33 L·s-1·mmol -1。研究结果为嗜热木糖异构酶的进一步工业应用奠定了基础。 相似文献
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【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。 相似文献
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根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种 相似文献
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提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。 相似文献
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克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280),将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%(V/V)时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5~9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。 相似文献