绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）自发现以来,由于具有自发荧光等特性,在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报道分子,在研究蛋白质相互作用和构象变化、检测蛋白质表达、蛋白质和细胞荧光示踪中,起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析．介绍其作为荧光标记在蛋白质研究中的应用,并展望进一步的研究前景。     

含Dsred类似生色团的红色荧光蛋白的发展及应用

自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来,荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具．随着红色荧光蛋白DsRed的出现,各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现．其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很大,对于红色荧光蛋白而言,大多数的红色荧光蛋白的生色团类型为DsRed类似生色团,在此基础上又出现了Far-red DsRed类似生色团．目前,含DsRed类似生色团的荧光蛋白主要有单体红色荧光蛋白、光转换荧光蛋白、斯托克斯红移蛋白、荧光计时器等．这些优化的荧光蛋白作为分子探针可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪,已经在生物工程学、细胞生物学、基础医学领域得到广泛应用．本文综述了含DsRed类似生色团的荧光蛋白的研究进展及其应用,以及由此发展起来的远红荧光蛋白在活体显微成像技术中的应用,并展望了荧光探针技术研究的新方向．     

用于植物基因研究的mCherry表达载体构建及定位表达

荧光蛋白在生物学研究中具有广泛的应用和重要的作用,其中红色荧光蛋白mCherry因其颜色和良好的特性,对于植物基因研究具有重要的使用价值,本研究将mCherry基因构建到pBI121植物表达载体系统中,构建了pBI121MCS-mCherry载体。利用基因枪转化法转入洋葱表皮进行表达验证,显微镜观察结果显示整个洋葱细胞具有红色荧光,证明该载体能够在植物细胞中表达红色荧光蛋白。利用双酶切连接法将转录因子BpMYB4基因构建到该载体上,得到融合表达载体pBI121MCS-mCherry-BpMYB4,在洋葱表皮中表达,结果显示细胞核具有红色荧光,证明该载体能够准确表达融合蛋白,进行亚细胞定位。同时融合基因时不再需要中间载体,构建简便,引入的KpnⅠ酶切位点,增加了可选择性。因此该载体可用于植物基因表达定位及转基因植株筛选研究中,为今后的白桦基因组学研究提供了材料。     

光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用

光激活荧光蛋白是指用特定光照射时, 其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质, 并从多个方面对其应用进行了概括, 包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显微镜中的应用等, 且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。     

光激活荧光蛋白及其在植物分子细胞生物学研究中的应用

光激活荧光蛋白是指用特定光照射时,其荧光特性发生显著改变的一类荧光蛋白。借助光激活荧光蛋白的这种特性,可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪。该文介绍了目前光激活荧光蛋白的性质,并从多个方面对其应用进行了概括,包括分子标记与动态分析、蛋白质相互作用、细胞器及细胞组分动态研究、细胞追踪以及在光激活定位显微镜中的应用等,且对目前光激活荧光蛋白在植物分子细胞生物学中的应用进行了详细介绍。     

荧光蛋白研究进展

荧光蛋白在生物学众多研究领域中有着广泛的应用,基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为活细胞或活体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具。本文对现有荧光蛋白的种类和理化特性,及其在生物学研究中的应用进行了综述介绍。重点介绍了近年来荧光蛋白在亮度、Stokes位移、光谱改变等方面的研究进展,介绍了光转换与光活化荧光蛋白及其在超分辨荧光成像技术中的应用。最后对荧光蛋白未来的发展方向进行了展望。     

绿色荧光蛋白——照亮生命科学的一盏明灯

绿色荧光蛋白的发现及应用具有划时代的重要意义,它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段,并且在此基础上改造发展和发现了一系列荧光蛋白,拓展了应用范围。这使得对微观生物学的研究也可以进入一个时空结合,研究鲜活动态过程的新时代。本文主要回顾总结了绿色荧光蛋白的发现、优化改造及其应用。     

带红色荧光蛋白靶向线粒体载体的构建与表达

选取由核表达的线粒体蛋白细胞色素C氧化亚单位Ⅷ（COX8）的前导序列为靶序列,从人胚胎肺成纤维细胞中扩增出COX8的前导序列,插入到pcDNA3．1／myc—HisA中,并将pDsRED1-n1中的红色荧光蛋白序列RFP克隆至COX8的下游,形成融合蛋白。在脂质体的介导下,将重组载体转染至肿瘤细胞中,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达及分布情况。构建的靶向线粒体的载体以及以红色荧光蛋白为报告基因的靶向线粒体的载体,经酶切、DNA序列测定,结果表明构建正确。将pcDNAmito—RFP转染到HeLa细胞的线粒体中,16h即可见散在荧光,72h达高峰,第10d开始减弱。以上结果表明成功构建了以红色荧光蛋白为报告基因的线粒体靶向的特异表达载体,在靶序列的引导下将红色荧光蛋白输入到线粒体中,为进一步对线粒体疾病的基因治疗研究提供了重要工具。     

P68——一种广泛存在于真核细胞中的核蛋白

本文对近年来在真核细胞中发现的Ｐ６８核蛋白研究历史、分布情况、生物学功能以及其基因在人染色体上的定位等方面进行了系统的评述。同时还对该蛋白在结构特征与功能特性及与某些重要功能蛋白间的相关关系进行了讨论。     

利用荧光蛋白标记西瓜枯萎病菌的过氧化物酶体及细胞核

西瓜枯萎病是一种世界范围的西瓜毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)。研究病原菌生长发育和侵染的机制是解决病害的根本途径。利用荧光蛋白对细胞或细胞器进行标记,是病原菌研究中的重要方法。该研究利用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白对FON的细胞核和过氧化物酶体进行了荧光标记。通过农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,AtMT),该文将3种不同的荧光定位载体分别导入FON,获得了细胞核红色荧光标记的转化子(潮霉素抗性,含mCherry-H2B融合蛋白),以及过氧化物酶体绿色(潮霉素抗性,含GFP-PTS1融合蛋白)和红色(潮霉素抗性,含DsRED-PTS1融合蛋白)荧光标记的转化子各1种。在标记细胞核的菌株中,菌丝、孢子都可见明亮、圆形的红色荧光点,荧光点与DAPI染色标记的细胞核区域完全重合。在过氧化物酶体标记的菌株中,菌丝、孢子中可见明亮的红色或绿色荧光成小点状分布,符合过氧化物酶体的分布特征,而且在脂类物质诱导的条件下,荧光点的数量明显增加。此外,该文还利用细胞壁荧光染色剂卡氏白对3种荧光蛋白标记菌株进行染色。结果显示,卡氏白染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光在FON中互不干扰。转化子继代培养和初步分析表明,其表型与野生型无差异,菌株继代后荧光表达稳定、定位明显。该结果为进一步研究FON细胞器动态、生长发育与致病分子机制提供了方法和工具。     

荧光蛋白在肿瘤分子影像研究中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是在水母中发现的新型报告分子,该蛋白及其衍生物能在多种生物体内表达并发出荧光,是目前在生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。尤其是在肿瘤的研究中,荧光蛋白的分子影像可为深入揭示肿瘤发生发展的病理过程的机制,以及对其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段。     

基于CRISPR/Cas9系统对干酪乳杆菌进行红色荧光蛋白标记

本实验利用CRISPR/Cas9系统对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) LC2W进行红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)标记,用于研究干酪乳杆菌在肠道内的分布和定植状况,评价其作为益生菌的功能。首先,基于本实验室已有的干酪乳杆菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLCNICK-1628构建重组质粒pLCNICK-1628-RFP,电转入干酪乳杆菌LC2W感受态细胞中,使干酪乳杆菌基因组中的LC2W-1628基因被红色荧光蛋白基因替换,从而使干酪乳杆菌LC2W能表达出红色荧光蛋白。得到红色荧光标记的干酪乳杆菌LC2W突变株后,测定了其荧光强度-OD600标准曲线,发现RFP在干酪乳杆菌LC2W中能稳定表达。     

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用

绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequoria victoria)体内的一种发光蛋白,近十年来成为在生物化学和细胞生物学研究和应用中用得最广泛的蛋白质之一。文章就绿色荧光蛋白的特性及其在植物分子生物学中应用的研究进展作了概述。     

酿酒酵母基因组位置效应对外源基因表达的影响

外源基因元件和模块在底盘细胞中发挥特定功能是合成生物学研究的基本过程,而外源元件和模块在基因组中的位置对其功能的实现具有显著影响。为了系统、全面地表征酿酒酵母基因组位置效应对外源基因的表达影响,以绿色荧光蛋白为报告基因,通过双交换同源重组方法,对酿酒酵母单基因敲除库进行高通量转化,构建酿酒酵母基因组单位点荧光标记菌株库。结合流式细胞术和高通量测序技术对单位点荧光标记库菌株进行分析,构建高表达位点库和低表达位点库,共发现促进绿色荧光蛋白表达的位点428个,抑制绿色荧光蛋白表达的位点444个。通过分析高、低表达位点在酵母染色体上的分布,从全基因组尺度上对酿酒酵母基因组整合位置对基因表达的影响进行表征。本研究可为酿酒酵母基因组位置效应的分布规律和产生机理研究提供重要参考,对外源蛋白工业生产和合成生物学中的基因表达精细调控也具有重要的指导意义。     

SNAP-tag蛋白标记技术在生物学领域的应用研究进展

蛋白质特异性标记方法的发展对于研究细胞内多种生理生化过程具有十分重要的意义。近年来,多种蛋白质特异性标记技术被开发应用。SNAP-tag凭借对靶蛋白标记所具有的高特异性和稳定性,以及配体功能的多样性等独特优势,从众多靶向标记技术中脱颖而出。迄今为止,SNAP-tag技术已在生物学的众多领域中成为具有巨大潜力的研究手段。在此,重点对SNAP-tag技术在荧光成像、蛋白质功能和性质研究,以及疾病诊断治疗等领域的应用进展进行综述。     

红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立

目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态。结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。     

珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用

绿色荧光蛋白作为标记蛋白和报告蛋白在生物学研究中应用越来越广。但在荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)等技术中存在一些缺陷,需要更大波长范围的荧光蛋白。最近研究发现了多种来源于珊瑚和海葵的红荧光蛋白,这些长波长的荧光蛋白对绿色荧光蛋白是一种很好的代替和补充,可以实现细胞内多荧光标记,提供更理想的FRET荧光对。经随机突变和定点突变等方法改建获得的红荧光蛋白变种显示出更高的荧光强度,成熟时间也更短。目前应用较多的是来源于香菇珊瑚(Discosomasp.)的红荧光蛋白DsRed。     

荧光标记在植物花粉管构造及生长特性研究中的应用

花粉(管)构造及花粉管生长特性长期以来一直是人们研究的焦点,近年来,随着生物学和新材料不断发展,新荧光标记技术的运用,植物花粉管生长特性的研究取得巨大进步.本文介绍了花粉管生长特性等研究中用到的主要荧光标记物质,包括:苯胺蓝、Flou-3、罗丹明鬼笔环肽、TUNEL标记以及荧光蛋白等的理化性质、作用原理,并对应用荧光标记探索植物花粉管构造及生长特性的研究进展进行了综述.     

pH敏感型荧光蛋白及其在植物细胞生物学中的应用

pH敏感型荧光蛋白, 即pHluorin, 是荧光强度及光谱特征随环境pH值的变化而改变的一类荧光蛋白。人们通过对密码子使用偏好和特定剪切位点的修饰, 已使pHluorin及其衍生物成功地在动物、植物和真菌细胞中正常表达, 为测量细胞内微环境pH值的变化, 并研究活细胞内依赖或导致pH变化的生理过程提供了有力工具。该文总结了目前已报道的pH敏感型荧光蛋白的种类及特性, 并对其在细胞生物学, 特别是植物细胞生物学中的应用进行了详细介绍。随着报告基因技术及检测方法的不断改进, pHluorin将在植物科学领域发挥更大的作用。     

甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中最适荧光蛋白报告基因的鉴定

近年来荧光蛋白成为基因工程中常用的遗传标记,详尽解读不同荧光蛋白基因在甲基营养菌中的表达可以鉴定最适的荧光报告基因。克隆了常用的绿色荧光蛋白eGFP、红色荧光蛋白mCherry、黄色荧光蛋白YFP以及其他来源的绿色荧光蛋白wGFP和红色荧光蛋白RFP共5种荧光基因,构建相应的表达载体并在甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1中进行表达。通过荧光成像观察和SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行荧光蛋白表达鉴定。通过细菌生长曲线、荧光总量和相对荧光强度的测定,进行荧光稳定性和表达强度的鉴定。结果在转化子中均检测到目的荧光蛋白条带,但RFP荧光表达量痕量且未检测到荧光成像;稳定性最强和相对荧光强度最高的是YFP,是常用eGFP的1.6倍,mCherry的3.4倍。在M. extorquens AM1中最适荧光蛋白为YFP。