盐穗木转录因子HcSCL13转录激活的体外鉴定及植物表达载体的构建

通过同源重组的方法将盐穗木盐响应GRAS家族转录因子HcSCL13基因(GenBank登录号:KC68640)构建至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7上,转化酵母菌Y2HGold,通过自激活性和毒性检测确定该转录因子的体外激活能力。试验表明,重组菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold对宿主菌无毒性,且该菌株表达的融合蛋白能够激活报告基因的表达,说明HcSCL13具有转录激活域,是一类转录因子。成功构建了HcSCL13基因的植物表达载体和亚细胞定位表达载体,为进一步在体内研究该基因的耐盐功能奠定了基础。     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。     

大豆转录因子GmERF5启动子的克隆及活性分析

乙烯响应因子(Ethylene-responsive factors,ERFs)广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答。从大豆吉林32的基因组DNA中分离到GmERF5的启动子片段,全长1 924 bp。该区段含有9种与逆境相关的顺式作用元件,即G-box、GT-1、LTRE-1、W-box、TL1、DPBF、MYB、MYC和BIHD10S。将该启动子构建到植物表达载体pCAMBIA1301上与葡萄糖苷酸酶(GUS)基因融合,注射法转化烟草叶片,并进行干旱、高盐和低温处理,通过GUS组织化学染色和GUS荧光值的测定分析启动子的启动活性。结果表明,在未处理条件下,该启动子能驱动下游GUS基因的表达。干旱和低温处理10 h能明显增强GmERF5P的启动活性。     

小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析

克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性.设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区.将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luc.报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、HUVEC及NIT-1细胞系,48h后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况.构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;转染4种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056-+1)具有较强的转录活性.成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056-+1)具有较强的启动子活性.     

盐穗木HcPEAMT基因的克隆及表达分析

依据盐穗木编码PEAMT的EST序列设计引物,通过快速扩增cDNA末端技术,获得盐穗木磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)全长cDNA,命名为HcPEAMT。序列分析表明HcPEAMT基因开放阅读框为1 482bp,编码494个氨基酸,推测分子量为56.3kD,理论等电点为5.51。保守结构域分析表明,HcPEAMT含有2个独立的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的保守结构域,每个结构域含有4个基序。系统进化树分析确认HcPEAMT与盐生植物盐角草的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,盐胁迫3h时,盐穗木同化枝和根中HcPEAMT基因的表达迅速上调并达到最大值,分别为对照的4.3倍和6.7倍。脱落酸(ABA)胁迫3h时,同化枝中HcPEAMT的表达量达到最高,而根中HcPEAMT的表达在12h才达到最高,表达量分别为对照的2.6和2.5倍。研究结果表明,HcPEAMT基因表达受盐胁迫的强烈诱导,也受ABA胁迫的诱导。该研究结果有助于阐明HcPEAMT基因表达与植物抗逆性的相关性。     

盐穗木HcDmc1基因的克隆和表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得盐穗木DNA损伤修复基因的cDNA序列,其开放阅读框1 035bp,编码344个氨基酸,命名为HcDmc1。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有RecA蛋白家族典型的保守结构域;统进化树分析显示HcDmc1为独立的分支;亚细胞定位于细胞质,为无信号肽、不跨膜的稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,盐穗木在100mmol/L NaCl胁迫7d后,同化枝中HcDmc1基因表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的6.58倍;在700mmol/L NaCl胁迫14d后根中HcDmc1基因表达最高,约为对照的1.79倍。研究表明,HcDmc1基因表达受盐胁迫诱导。     

盐胁迫下盐穗木差异表达基因的转录组信息分析

盐穗木是一种理想的耐盐模式植物,本文利用生物信息学方法分析盐穗木在盐胁迫下差异表达基因的转录组,为盐穗木耐盐机理及耐盐关键基因的储备提供理论依据。基于盐穗木在盐胁迫（600 mM NaCl）下差异表达的转录组数据,以代谢通路中基因表达数量最多的7条通路和与胁迫刺激响应相关的共8条通路为主要研究内容,筛选出上调和下调表达差异显著的unigene,将其与NCBI数据库中所有物种相关基因进行Blastx比对,筛选出通路中上调和下调差异表达最显著的unigene,同时对差异表达活跃的unigene进行分类汇总。共得到23组差异表达活跃的基因类群,分别是乙烯响应因子、WRKY转录因子、Myb转录因子、bZIP转录因子、葡聚糖酶、6-磷酸脱氢酶、醛脱氢酶、柠檬酸合成酶、蛋白激酶等,推测这些类群的基因在盐穗木耐盐机制中发挥重要作用。     

盐穗木过氧化氢酶基因的克隆与功能分析

利用同源基因克隆法,从新疆荒漠盐碱地多年生灌木盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得盐穗木过氧化氢酶基因(HcCAT1)。序列分析表明,HcCAT1基因开放阅读框为1 479 bp,编码492个氨基酸,推测编码蛋白质的分子量为56.7 kD,等电点为6.84。基因序列比对发现,HcCAT1与多种植物过氧化氢酶基因具有较高的同源性。半定量RT-PCR结果表明,HcCAT1基因受盐胁迫而上调表达。将构建的重组质粒pET32a-HcCAT1转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导重组蛋白His-HcCAT1的表达;SDS-PAGE和Western印迹检测显示,重组蛋白的分子量大小为77.7 kD,其大小与推测的大小一致;在低温诱导下以可溶性形式表达,且表现出一定的过氧化氢酶活性。盐胁迫实验结果显示,在添加400 mmol/L NaCl、400 mmol/L KCl以及300 mmol/L甘露醇的LB培养基中,重组质粒转化菌的生长情况和生长速率明显优于对照,表明HcCAT1可明显提高大肠杆菌的耐盐性。该研究结果将有助于从抗氧化角度认识盐生植物盐穗木的耐盐分子机理。     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

短期盐胁迫下盐穗木的转录组分析

盐穗木（Halostachys caspica）是荒漠盐碱地广泛分布的盐生植物,具有极强的耐盐性。为揭示盐胁迫下盐穗木基因组层面的基因表达变化特性,通过对300和500mmol·L^-1 NaCl胁迫3h的盐穗木同化枝进行了转录组测序。有效序列组装共得到153298条平均长度为643bp的unigenes,进行GO和KEGG功能聚类,分别获得47个GO功能小类和118个KEGG通路。差异表达基因分析显示,短期低盐（300mmol·L^-1）响应基因有4432个,高盐（500mmol·L^-1）响应基因有2580个,两个胁迫的共差异基因有1245个,主要富集在细胞过程、代谢过程和响应刺激等类别中。从短期盐胁迫下盐穗木转录组筛选出渗透调节和活性氧清除的相关基因,大多为上调基因。说明盐穗木能够通过促进渗透调节和增强活性氧清除提高短期的盐胁迫适应能力。     

玉米bHLH类转录因子ABP7的启动子克隆及其活性分析

bHLH类转录因子广泛存在于植物中,在花的形态建成、光和激素信号转导等方面发挥着重要作用,但其表达调控机理尚待深入研究。从玉米中克隆了bHLH类转录因子ABP7,初步研究结果显示它可能参与了籽粒形成、激素应答等多个信号转导途径的调控。为进一步阐明ABP7基因上游调控途径,克隆了ABP7的5′侧翼序列,利用原生质体瞬时转化体系验证了其启动子活性,并对其顺式作用元件进行了分析。结果显示,位于ABP7基因起始密码子上游长为2 266 bp的DNA序列具有启动子活性,能够启动报告基因的表达,并且存在许多潜在的与GA、IAA和ABA激素信号转导和逆境胁迫响应相关的元件,为进一步鉴定ABP7基因发挥作用的信号途径、上游调控因子和分子机理以及ABP7基因在玉米生长发育和逆境应答中的功能奠定了基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinxl基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

花粉发育相关基因BcMF13不同转录本的克隆及分析

在克隆花粉发育相关基因BcMF13时,用RACE技术进行3’端扩增,得到了两个不同长度的3’转录本。与EST库比对,发现与其相似性高的序列都来源于十字花科芸薹属、萝卜属等植物的生殖器官,并且在这些近源属中也出现不同转录本。这些不同转录本的存在说明BcMF13存在剪切异构体,调控过程灵活复杂,反映出该基因具有重要功能。同时,对BcMF13基因的RT-PCR表达研究表明,它只在可育株系中表达,在不育株系中不表达,且主要集中在大花蕾、雄蕊中表达。分析BcMF13推导的蛋白结构,发现其编码的蛋白包含多个生物活性位点。以上结果均表明BcMF13与花粉育性相关,多个剪切异构体的发现说明BcMF13在执行生理功能时较为活跃。     

13个苹果NAC转录因子基因的克隆与表达分析

利用同源比对和RT-PCR技术,从紫弘富士苹果(Malus domestica (Suckow)Borkh.‘Zihong Fuji’)中克隆了13个NAC转录因子基因:MdNAC40～45,MdNAC47～53(GenBank登录号为MG099877～MG099882,MG099884～MG099890)。序列分析表明,其开放阅读框(ORF,open reading frame)分别为1470 bp、1065 bp、912 bp、885 bp、948 bp、1041 bp、1182 bp、639 bp、705 bp、1830 bp、1980 bp、747 bp和1137 bp。进化分析表明,MdNAC41属于AtNAC3组,MdNAC40、MdNAC42～43和MdNAC45～53属于NAM组,MdNAC44属于VND组。亚细胞定位预测结果显示,MdNAC40～45、MdNAC47～50和MdNAC52～53可能定位于细胞核中;MdNAC51可能定位在细胞质或细胞核中。Array结果显示,13个MdNAC基因在16个被检测组织中均有不同程度的相对表达水平。RNA-seq结果显示,MdNAC43、MdNAC45、MdNAC47、MdNAC49和MdNAC51的表达明显受斑点落叶病菌(AAAP,Alternaria alternata apple pathotype)侵染的诱导。实时荧光定量PCR分析表明,在150 mmol/L NaCl处理下,嘎啦组培苗中MdNAC45、MdNAC47和MdNAC52的转录水平受到诱导,而MdNAC40、MdNAC48和MdNAC51的转录水平下调;在300 mmol/L甘露醇处理下,MdNAC50转录水平受到诱导,MdNAC41转录水平下调。这表明MdNAC基因多呈组成型表达,并受斑点落叶病菌(AAAP)、NaCl和甘露醇诱导或下调,可能参与调控苹果生长发育和逆境胁迫等过程。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

小麦盐胁迫相关基因TabHLH13的克隆与分析

在对小麦全长cDNA克隆进行大规模测序及转录因子功能研究过程中,筛选到一个与盐胁迫相关的bHLH转录因子基因,将其命名为TabHLH13。TabHLH13的全长cDNA序列为1072 bp,开放阅读框为720 bp,编码一个具有240个氨基酸残基的bHLH转录因子;对TabHLH13的基因组和cDNA序列比较分析表明该基因包括5个外显子和4个内含子;同源序列分析发现,TabHLH13与来自大麦和短柄草中的bHLH蛋白序列相似性最高,分别为96.2%和90.5%;电子定位发现TabHLH13位于小麦第7同源群的7DL上;亚细胞定位结果表明,TabHLH13编码一个定位在细胞核中的蛋白;组织表达特性分析表明该基因在小麦根、茎、叶、颖壳、雌蕊和花药中均有较强的表达;半定量RT-PCR与qRT-PCR结果表明TabHLH13是一个受盐胁迫诱导表达的基因。     

盐穗木水通道蛋白基因的克隆与功能鉴定

非生物胁迫(如盐渍和干旱)会引起植物水分代谢的紊乱,导致植物细胞水分丧失,直接抑制植物的生长发育。研究水通道蛋白(aquaporins,AQPs)在非生物胁迫下对植物生理功能的影响十分重要。本研究利用RACE技术克隆获得一个盐穗木(Halostachys caspica)水通道蛋白家族亚类质膜内嵌蛋白(plasma intrinsic protein,PIPs)基因,命名为Hc PIP1。Hc PIP1基因全长序列为1 244 bp,包含858 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,编码285个氨基酸,分子量大小约为30.6 k D。q RT-PCR检测表明Hc PIP1在盐穗木根部的表达量显著高于同化枝中,盐胁迫诱导其上调表达。在酿酒酵母INVSc1中Hc PIP1的异源过表达显著提高了重组菌的耐盐能力;和野生型植株相比过表达Hc PIP1的拟南芥能够显著缓解渗透胁迫和离子胁迫对生长的抑制,并且根长明显比野生型的长。结果表明Hc PIP1在胁迫时能够通过增加根的生长以抵御胁迫的影响。