苦荞转录因子基因FtDREB1和FtDREB2的克隆及其对非生物胁迫的应答

基于苦荞(Fagopyrum tataricum)花期转录组数据,采用RT-PCR技术克隆到2个编码DREB类转录因子的基因,命名为Ft DREB1和Ft DREB2。氨基酸多重序列比对表明,其编码蛋白Ft DREB1和Ft DREB2具有与拟南芥DREB相同的保守AP2结构域。进化树分析表明,Ft DREB1和Ft DREB2与抗逆相关DREB转录因子归为A2亚家族。实时荧光定量PCR分析表明,在PEG模拟的干旱胁迫下,Ft DREB1和Ft DREB2表达量有所上升,峰值分别在2 h与12 h,分别为对照组的2.09倍(p0.01)和2.83倍(p0.01);低温与Na Cl胁迫下,Ft DREB1和Ft DREB2表达量均显著下降,趋势基本一致。本研究推测Ft DREB1和Ft DREB2基因以相似的应答模式参与了苦荞对不同非生物胁迫的应答过程。     

梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在应激反应相关基因的调控中起重要作用。本研究利用RT-PCR方法从梭梭组织中获得Ha DREB2A基因开放阅读框(ORF)全长(Gen Bank登录号为:KP765243)。生物信息学分析表明,该基因ORF长1 083 bp,编码360个氨基酸,蛋白的分子量为40.5 k D,理论等电点(p I)为5.07,该蛋白在90(K)~143(R)区域含有一个典型的AP2保守结构域。通过物种间系统发育树可以看出Ha DREB2A与Sb DREB2A进化关系最接近,二者属于同一进化分支。半定量RT-PCR表达模式分析显示,该基因在梭梭同化枝、根、茎、花和种子中均有表达,且在同化枝中的表达量最高,并且受干旱、高盐和外源ABA的诱导。     

日本结缕草‘胶东青’DREB2.2基因克隆及表达模式研究

DREB(dehydration responsive element binding protein)是植物中普遍存在的一类重要转录因子,参与植物逆境响应和生长发育过程。以日本结缕草‘胶东青’为材料,克隆获得了DREB2.2基因的编码区序列,分析了该基因的生物信息学特征,通过半定量PCR技术检测其逆境表达模式。测序结果表明,‘胶东青’DREB2.2基因存在长、短两个转录本。长转录本DREB2.2-L编码区长1 067 bp,多含一个长50 bp的序列,阅读框提前终止,仅推测编码65个氨基酸。短转录本DREB2.2-S编码区长1 017 bp,推测编码338个氨基酸,蛋白质分子量37.3 KD,等电点p I为4.86,含有一个保守的AP2结构域和核定位序列,属于DREB亚家族A-2组成员。半定量PCR结果显示,DREB2.2-S和DREB2.2-L在正常生长条件下有表达,低温胁迫时表达量上调,胁迫2 h时最高,干旱胁迫2 h和24 h时轻度上调表达,高盐胁迫下表达量无显著变化。在相同条件下,DREB2.2-L的表达量均略高于DREB2.2-S。     

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且...     

盐地碱蓬DREB同源基因SsDREB的功能研究

Ss DREB是从盐地碱蓬克隆获得的一个DREB2类转录因子,其表达受高盐和干旱诱导,而对ABA和低温处理反应不明显。本研究将Ss DREB与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体并在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达,结果表明SsDREB编码蛋白定位在细胞核中;酵母转录激活实验证明,Ss DREB能特异性结合DRE顺式作用元件,并激活下游报告基因的表达;采用农杆菌介导法将Ss DREB基因在35S启动子的驱动下转入烟草中,获得的转基因植株对干旱和盐胁迫抗性均显著提高;为研究Ss DREB过量表达提高转基因烟草抗旱、耐盐能力的分子机制,选取烟草中与提高质膜稳定性、消除活性氧和渗透平衡相关的8个逆境胁迫相关基因,以烟草α-tublin基因做为内参,利用半定量RT-PCR方法分析在正常生长条件下这8个基因在转基因烟草和对照烟草中的表达情况,实验结果表明这8个基因都受外源Ss DREB基因的调控,其中6个基因在转基因烟草中的表达量显著高于非转基因植株。     

盐芥ThDREB2B基因克隆及功能分析

利用RACE技术从抗逆模式植物盐芥中克隆获得了1个DREB(dehydration responsive element binding)类转录因子基因,命名为ThDREB2B(NCBI登录号EF653377)。结果表明:(1)ThDREB2B基因cDNA全长1 486bp,包含1个954bp的开放阅读框,编码316个氨基酸;推测编码的蛋白质分子量约36.0kD,等电点为4.81,第76～135位氨基酸构成1个AP2结构域。(2)系统进化分析表明,ThDREB2B属于DREB亚家族的A-2亚组,与拟南芥AtDREB2B基因遗传距离最近。(3)半定量RT-PCR检测显示,ThDREB2B基因在正常生长条件下低丰度表达,在低温、干旱或高盐胁迫下上调表达。(4)酵母单杂交结果表明,ThDREB2B蛋白能与DRE元件特异结合,但转录激活能力弱。推测ThDREB2B蛋白可能需要翻译后修饰以获得转录激活功能。     

草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB的克隆及功能鉴定

DREB(dehydrationresponsiveelementbindingprotein)蛋白是一类在植物中所特有的,能与DRE(dehydrationresponsiveelement)顺式作用元件特异性结合的转录因子,调控与干旱、高盐以及低温等逆境胁迫应答有关基因的表达.根据狗牙根近缘植物的DREB转录因子的AP2EREBP保守结构域的基因序列,通过RTPCR和RACE的方法分别从冷诱导和盐诱导的狗牙根cDNA中扩增到了2个似DREB基因,分别命名为BeDREB1和BeDREB2,并已提交NCBIGenBank,其登录号分别为AY462117和AY462118.这两个基因的编码框均为753个碱基,编码251个氨基酸,具有DREB转录因子的典型特征.两种逆境胁迫下扩增的基因序列同源性很高,达到了97.8%.利用酵母单杂交真核转录激活的方法进行了功能鉴定,证明BeDREB1和BeDREB2蛋白均可以与DRE顺式作用元件结合,激活下游报告基因HIS3的表达.RTPCR结果显示,BeDREB1基因受冷胁迫诱导表达,而BeDREB2受盐胁迫的诱导表达,且随着诱导时间的不同,表达量也在发生变化.上述结果表明,从狗牙根中克隆到的BeDREB1和BeDREB2基因属于DREB转录因子家族的新成员,在狗牙根中分别与冷胁迫和盐胁迫的信号转导有关.     

毕氏海蓬子SbDREB基因的克隆与表达分析研究

以毕氏海蓬子的基因组为模板,通过PCR技术扩增到一个编码DREB蛋白AP2保守结构域的基因片段;根据该片段序列设计引物,以毕氏海蓬子经NaCl处理的植株肉质茎cDNA为模板,应用RACE技术获得该基因的cDNA全长,命名为SbDREB(GenBank登录号:JF894301)。SbDREB基因cDNA全长1206bp,包含一个编码284个氨基酸的完整开放阅读框。对氨基酸序列比对分析表明,该蛋白在靠近N端具有典型的AP2/EREBP保守结构域,且该结构域与一些高等植物DREB类转录因子的AP2区域具有高度同源性。进化树分析表明SbDREB属于DREB亚家族中的A-6亚族。实时荧光定量PCR结果显示:干旱、高盐和ABA能够诱导其表达,而低温则使其表达下调,表明该基因在毕氏海蓬子植株对干旱、盐和低温等非生物胁迫的应答中起作用。     

蒙古沙冬青AmDREB2C基因的克隆及表达分析

蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有很强的抗寒抗旱特性。利用PCR方法从该植物克隆到转录因子Am DREB2C的c DNA和基因组DNA的全长编码区,二者均由1191 bp组成,无内含子序列,编码由396个氨基酸残基组成的蛋白,其中含1个AP2结构域和1个核定位信号。表达分析显示,Am DREB2C的转录受低温和干旱胁迫的诱导。此外,将该基因编码区c DNA成功构建到植物表达载体p CAMBIA3300-35ST上,为后续研究其功能奠定了基础。     

梨DREB基因家族全基因组鉴定及分析

本研究为鉴定梨DREB基因,分析其生理特性和结构,并研究DREB蛋白的相互作用以及在不同逆境中的表达差异,通过生物信息学方法,对梨DREB转录因子进行了鉴定与分析。如利用本地BLAST、Pfam等搜索、鉴定DREB蛋白;采用Protparam、Signal P、SPOMA、MEME数据库、DNAMAN、MEGA6.0等对蛋白进行结构特性和进化关系分析;基于String数据库对DREB蛋白进行功能互作分析;并运用拟南芥Illumia RNA-Seq数据进行同源表达分析。从梨全基因组中鉴定了60个DREB基因,通过与拟南芥DREB基因聚类分析,共分为6个亚组(A1~A6)。编码的氨基酸残基数在99~496个之间,平均含有250个氨基酸残基,整体呈弱酸性。系统分析了Pbr DREBs蛋白的保守基序和基因结构,发现这些Pbr DREBs蛋白都含有一个典型的AP2/ERF结构域,这个结构域含有55个左右的氨基酸残基,大部分以YRG保守元件开始,到RAYD保守元件终止。对Pbr DREBs蛋白之间的功能联系网络进行了系统的研究,发现DREB转录因子在梨的生长发育过程及其多种逆境反应的信号转导中发挥着重要作用,且在逆境调控中各亚组成员之间也可能存在交叉作用,其中,A1亚组即CBF转录因子在蛋白质相互调控中起重要作用。并利用同源拟南芥RNASeq数据对Pbr DREBs蛋白进行了低温、干旱等非生物胁迫下的同源分析,表明DREB蛋白在多种胁迫中都起到了重要作用。初步鉴定出的梨60个DREB基因在功能、结构、特性等方面与拟南芥及其它已报道的物种DREB基因相似,并在低温、干旱等逆境中起到重要作用。     

海岛棉GbCBF6基因克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

该研究根据棉花生物信息数据库,采用PCR方法从棉花(Gossypium barbadense L.)中克隆了1个CBF/DREB转录因子基因,命名为GbCBF6(GenBank登录号为KR233255)。GbCBF6基因开放阅读框为753bp,编码251个氨基酸,预测分子量为27.82kD,等电点为7.68。氨基酸多重序列比对结果表明,GbCBF6基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的同源性,含有1个AP2功能结构域和2个特征序列基序;与棉花已经克隆的4个GhCBF基因的氨基酸序列差异较大,是1个新的棉花CBF基因。系统进化树分析表明,GbCBF6基因属于DREB亚家族中的A-1亚组。RT-PCR分析表明,GbCBF6基因表达受干旱胁迫下调,而受4℃低温上调,在高盐(200mmol/L NaCl)处理下其表达量先下降,后增加。推测GbCBF6基因在棉花非生物胁迫的调控中起重要作用。     

银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆及鉴定分析

DREB类转录因子特异地与DRE元件结合,在植物感受非生物逆境(干旱、高盐和低温)胁迫时,激活一系列逆境应答基因的表达。我们选用银新杨(Populus alba×P. alba var. pyramidalis)为材料,通过PCR和同源EST搜索的方法克隆得到了一个类DREB的基因,命名为PaDREB2。酵母单杂交实验表明,该基因编码的蛋白能特异地与DRE元件结合并激活下游报告基因的表达。用RT-PCR的方法研究了PaDREB2的表达模式,结果表明PaDREB2受低温、干旱和高盐的胁迫诱导。     

DREB1A 转录因子蛋白的原核表达

DREB1A是DREB转录因子的一员,它们都含有一段与DNA结合的保守区域,由58个氨基酸组成,称为EREBP/AP2结构域(EREBP/AP2 domain)。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。从拟南芥中克隆了DREB1A转录因子基因,成功构建了DREB1A基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达获得了DREB1A蛋白,但以包涵体形式存在。为以后深入研究DREB转录因子与DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。     

火炬松DREB1基因的电子克隆与生物信息学分析

利用来自Forest TreeDB数据库中热胁迫cDNA文库ESTs聚类、拼接组装的Unigene以及基因GO注释,得到了假定的火炬松DREB1基因,全长1 293bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列。采用DNAMAN软件分析碱基组成、限制酶切位点和重复序列等,结果发现,该序列与其他物种中克隆得到的DREB1具有较高的同源性,初步断定所电子克隆得到的cDNA序列为火炬松DREB1基因(PteaDREB1)。在此基础上,利用网上的公共数据库和相关软件(Antheprot等)对PteaDREB1编码的理化性质和一级结构进行分析,并模拟了其二级结构和三级结构。结果表明,该蛋白为疏水性非球形可溶蛋白,含有295个氨基酸,分子量为32.4kD,等电点为8.22;其二级结构以螺旋和卷曲为主,三级结构具有DREB蛋白家族中典型的结合DNA的AP2结构域。这进一步说明所克隆到的cDNA片断为火炬松DREB1基因。上述研究结果可为PteaDREB1基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用奠定基础,具有一定的现实意义和应用前景。     

纤毛鹅观草DREB类基因RcDREB1的克隆及其蛋白结合干旱应答元件DRE的功能验证

以纤毛鹅观草为材料,通过RT-PCR和RACE技术,作者首次克隆了一个纤毛鹅观草DREB类基因的全长cDNA序列,命名为RcDREB1。该基因编码蛋白含有一个保守的AP2结构域,表明该基因是AP2大家族的一个新成员。种系发生树分析表明,RcDREB1与小麦AP2家族DREB类基因高度同源。酵母单杂交试验表明,RcDREB1表达的蛋白具有特异结合干旱应答DRE元件的功能;通过实时定量PCR分析发现,高盐、干旱、重金属镉和低温胁迫均可诱导RcDREB1表达,但其对高盐反应较为显著。本研究表明,RcDREB1是DREB类转录因子基因,在介导植物响应逆境信号方面可能发挥着重要生物学功能,为进一步分析小麦族的进化和转基因应用奠定了基础。     

谷子DREBs亚家族的全基因组学分析

DREBs(dehydration responsive element binding)是植物中特有的一类转录因子,在干旱、低温、高盐等多种环境胁迫中发挥重要的作用。本研究在全基因组水平上对谷子中的DREB亚家族进行了生物信息学分析,在谷子基因组中共找到65个编码DREB的基因,分布在9条染色体上;根据其序列特点,分成(A1~A6)6个组;在基因结构和蛋白模体组成上,每组存在着各自的特点;串联重复和片段重复对谷子DREB亚家族的扩增发挥了重要作用;谷子进化过程中DREB基因受到了强烈的正选择,加速了该类基因的进化。这将为深入研究谷子DREB基因的功能奠定基础,同时也为揭示谷子的抗逆机制提供一定的线索。     

香鳞毛蕨DfDREB基因克隆与表达模式分析

DREB(dehydration-responsive element-binding)转录因子是响应非生物胁迫反应的主要调节因子,为探索DREB在多年生草本药用植物香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L.) Schott]抗逆过程中的功能,该研究克隆了DfDREB基因并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法分析了DfDREB基因在不同激素及干旱、NaCl、高温和低温等逆境胁迫处理下的表达模式。结果表明:(1)成功获得DfDREB基因全长1 203 bp,其编码401个氨基酸,相对分子质量为43.66 kD,等电点为6.13,是亲水性非分泌蛋白,该蛋白具有AP2保守结构域,属于AP2家族。(2)实时荧光定量PCR分析表明,DfDREB基因在香鳞毛蕨根、叶柄和叶中均有表达,其中在叶中表达量最高,根中表达量最低;在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)处理时,DfDREB基因表达上调,并都在1 h时表达量达到峰值;在脱落酸(ABA)处理时,DfDREB基因的相对表达量仅在12 h和24 h时呈上调表达,其余时间为下调表达;在干旱、NaCl和高温处理时,DfDREB基因表达均上调;低温处理0.5 h和12 h时DfDREB基因表达显著上调,但在低温处理1～6 h和24 h时无明显变化。研究表明,DfDREB基因响应激素和非生物胁迫处理,且基因表达受胁迫诱导。该研究结果为进一步探索香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定了基础。     

无核小枣木质素合成基因Zj4CL的克隆和表达分析

为研究无核小枣果实无核形成机理,应用RT-PCR扩增技术首次从无核小枣果实中克隆得到4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,4-Coumarate:Coenzyme A Ligase)基因,该序列长度1819 bp,包含1776 bp的完整开放阅读框,编码591个氨基酸,命名为Zj4CL(登陆号KP279930)。Zj4CL与基因组序列比对发现,该基因组含有5个外显子,4个内含子。序列比对和结构域分析表明,Zj4CL包含4CL基因家族的Box I和Box II保守区。进化树分析显示,Zj4CL与苹果(XP_008362825)的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,无核小枣在花后30 d左右基因表达量达到最大值,到花后40 d以后表达量明显下降。     

日本结缕草转录因子基因ZjDREB1.4的功能特征分析

DREB1(dehydration-responsive element binding protein1)是植物中广泛存在的转录因子,在应答非生物胁迫中起重要作用。该研究根据转录组测序数据,从暖季型植物日本结缕草‘Meyer’(Zoysia japonica Steud.)中克隆得到1个DREB1类转录因子基因,命名为ZjDREB1.4。结果表明:(1)该基因推测编码226个氨基酸,含有一个AP2结构域,其上下游具有DREB1组的典型特征序列。(2)半定量RT-PCR检测显示,在日本结缕草叶组织中,ZjDREB1.4基因在4℃低温、高盐和干旱胁迫下均上调表达,其中受低温诱导上调最显著。(3)亚细胞定位分析显示,ZjDREB1.4-GFP融合蛋白主要定位在细胞核中。(4)酵母单杂交结果显示,ZjDREB1.4蛋白具有强的转录激活功能,但与以ACCGAC为核心序列的DRE元件结合功能较弱。(5)与野生型拟南芥相比,超表达ZjDREB1.4的拟南芥植株的营养生长无明显改变,仅抽薹时间推迟3～8 d,但是对高温和冷冻低温胁迫的耐受能力明显增强。ZjDREB1.4基因具有抗逆功能,对植株生长发育的负效应又小,其在植物育种中的应用潜力值得进一步探究。     

过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力

CBF/DREB是一类植物中特有的转录因子,在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥重要功能。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker 312中克隆获得1个棉花CBF/DREB基因,命名为Gh CBF2,该基因编码一个由216个氨基酸组成的CBF蛋白。序列分析结果显示,Gh CBF2与其他植物的CBF蛋白类似,含有AP2转录因子典型的保守结构域。干旱或高盐胁迫处理明显增加了Gh CBF2基因的表达量。亚细胞定位分析结果发现Gh CBF2定位在细胞核中。将Gh CBF2基因构建到由35S启动子调控的植物表达载体p MD上并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),结果表明,在干旱和盐胁迫条件下,过量表达Gh CBF2基因拟南芥的成活率显著高于野生型,并且游离脯氨酸和可溶性糖含量也高于野生型,说明转Gh CBF2基因提高了拟南芥的耐盐抗旱能力。采用实时荧光定量PCR方法分析胁迫相关标记基因COR15A、RD29A和ERD6的表达情况,结果显示转基因株系中的表达量显著高于野生型,说明Gh CBF2参与调控拟南芥干旱和盐胁迫相关基因的表达。