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基于液滴微流控芯片的检测和筛选系统,因其具有通量高、成本低等显著特点,近年来备受关注。该系统生成的微液滴(皮升体积)具有直径均一、大小可控、互不交融(单分散性)等特性,它作为微反应器可以进行微生物及其代谢物包埋实验和高通量检测。因此,研究微液滴的相关特性及其应用具有重要意义。文中在液滴微流控芯片系统搭建的基础上,对重要氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)分别进行了微液滴包埋实验,研究了包埋微液滴的重要特性参数(如稳定性、扩散性等),探索了包埋微液滴对氨基酸检测分选的应用。实验表明,文中搭建的液滴微流控芯片系统可以稳定、均一地生成微液滴,微液滴大小可根据需要控制在2 0-5 0μm之间,微液滴间无交叉污染,包埋氨基酸的微液滴的检测筛选速度大约为每分钟6 0 0个。这个研究为高通量分析和筛选产氨基酸的微生物奠定了基础。 相似文献
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体外区室化(In vitro compartmentalization,IVC)是通过制备微液滴反应小室包裹单个基因(包含表达体系)或细胞进行反应和培养,从而建立表现型与基因型的偶联,并借助流式细胞仪(Fluorescence-activatedcell sorting,FACS)对液滴进行超高通量检测和筛选,进而快速获得目标基因或细胞的一种方法。IVC-FACS筛选方法已被广泛应用于蛋白质工程、酶工程等定向进化研究。但早期利用机械分散法生成的微液滴大小均一性难以控制,严重影响液滴的定量检测,降低了筛选的效率和准确性。随着微流控芯片制备技术的快速发展,在芯片内快速生成微液滴的技术也愈加成熟。本研究首先利用W/O (Water-in-oil)单层液滴生成芯片高速制备单分散的W1/O液滴,再将W1/O液滴重注入W/O/W (Water-in-oil-in-water)双层乳化液滴生成芯片制备均一的W1/O/W2双层乳化液滴。通过对油、水相流速与比值的优化,可以生成直径在15.4–23.2μm的单乳化微液滴,液滴可在培养数天内保持稳定。将单乳化液滴重注入双层乳化液滴芯片,通过调整油相流速,可以获得生成速度在1 000个液滴/s、直径在30–100μm的双层乳化液滴。利用双层乳化液滴包埋的大肠杆菌细胞能正常进行培养和目标蛋白的诱导表达,为后续建立基于液滴和流式细胞仪的菌株高通量筛选方法奠定基础。 相似文献
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《生物技术通报》2017,(1)
天然产物是新药研发的重要源泉。天然产物合成生物学通过设计、重构目标化合物的高效生物合成途径,借助宿主改造,利用发酵生产目标化合物,可以有效弥补有机合成化学在复杂天然产物类药物生产方面的不足。虽然合成生物学已经取得了一些进展,但是通过合成生物学技术使目标产物的产量达到工业化生产水平依然是一项非常具有挑战性的任务。综述了天然产物合成生物学体系的优化策略,通过综合运用单个元件、外源代谢途径、底盘系统和发酵条件的优化技术,可以实现生物合成系统的最优化,最大化目标产物的产量,为来源稀缺的复杂天然产物的开发提供持续、稳定、经济的原料供给,推动天然产物类新药的研发。 相似文献
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合成生物学(synthetic biology)与经典生物学研究的革命性区别之一是合成生物学能将生物实验的对象、方法、技术和流程高度标准化和模块化,创建出自动化与高通量的合成生物铸造模式。该模式通过复杂生物过程与自动化设施的结合,颠覆过往劳动密集型的研究范式,获得更高的技术迭代能力,极大促进了合成生物学的发展和产业化应用。值此天津工业生物技术研究所创立10周年之际,本文回顾了研究所在工业菌种自动化高通量编辑与筛选领域的系列重要工作进展,对基因克隆(gene cloning)、基因组编辑(genome editing)、编辑序列设计(editing sequence design)等生物技术的自动化实现,以及流式细胞、液滴微流控、全基因组规模扰动测序等高通量筛选技术进行了分析讨论,并展望了本领域未来的发展方向。望借此为创建具有自主知识产权的优秀菌种及其产业应用提供智能化、自动化和全链条覆盖的整体支撑能力。 相似文献
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代谢工程作为通过引入外源合成途径或改造优化代谢网络,进行高附加值的天然代谢产物生物合成的技术,已经得到广泛应用。但随着目标合成产物的结构日渐复杂,构建多基因的从头合成途径造成宿主生物代谢失衡与中间产物对宿主细胞产生毒害作用等一系列问题发生的可能性也随之增加。为解决这些问题合成支架策略应运而生,合成支架将途径酶共定位以提高局部酶和代谢物的浓度,来增强代谢通量并限制中间产物与宿主细胞环境间的相互作用,成为生物催化和合成生物学研究的热点之一。尽管由核酸、蛋白质构成的合成支架策略已经应用于多种代谢物的异源合成,并取得了不同程度的成功,但合成支架的精确组装仍然是一项艰巨的任务。文中详细介绍了合成支架技术的研究现状,详细阐述了合成支架技术的原理和实例,并初步探讨了其应用前景。 相似文献
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《中国细胞生物学学报》2019,(11)
在合成生物学的"设计-合成-测试-学习"闭环中,高通量筛选与测量技术日益受到重视。该文以酶元件的新活性检测、基因线路的活性检测、天然产物的活性筛选、研究大肠杆菌基因型与线虫宿主寿命表型之间的关系等为案例,介绍高通量筛选的共性器具与步骤、实验设计与分析方法,比较系统地整理了相关技术,以期为未来高通量筛选技术的进步提供参考与理论依据。 相似文献
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微流控芯片技术在药物研究尤其是天然产物活性成分高通量筛选方面得到越来越广泛的应用,本文主要讨论了微流控芯片技术的发展以及在天然产物研究与开发方面的应用,并对其应用现状进行了分析。 相似文献
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酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为最简单的真核模式生物被广泛应用于生命科学的各项研究中。目前,大多数天然产物的主要生产途径是从原材料中直接提取,该方法效率较低,同时消耗了大量的生物资源,已逐渐被新兴的合成生物学方法所取代。其中通过改造酿酒酵母自身的代谢途径并加入异源代谢途径生产目标天然产物已成为一种高效的资源获取途径。通过对外源基因启动子的优化及改造,调控外源基因在宿主中的表达水平,从而协调宿主自身代谢途径,定向合成目的代谢产物是酵母合成生物学和代谢工程的研究热点。从构建酿酒酵母合成天然产物过程中启动子结构、类型及优化表达的方法进行了综述,为相关研究者利用酿酒酵母作为底盘细胞进行合成生物学的研究提供参考。 相似文献
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)及其还原态是生物体通用的氧化还原辅酶和重要小分子,参与胞内众多代谢反应,因此调控NAD水平不仅难以选择性作用于代谢途径,还常常产生意外的生物学效应。最近研究发现利用非天然辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide,NCD),可构建正交的氧化还原催化体系,为调控胞内代谢提供了新机遇。为实现在产油酵母圆红冬孢酵母中建立NCD介导的氧化还原代谢,采用农杆菌介导转化方法,在基因组整合表达密码子优化的NCD合酶(NcdS)编码基因NCDS,获得系列有效表达NcdS的工程菌株。酶偶联法分析发现,工程菌细胞裂解液NcdS酶活达8.1×10-3 U/OD600 nm。通过高效液相色谱法(HPLC)和超高分辨率质谱检测,确定细胞裂解液可催化合成NCD。在培养基内补加5.0 mmol/L烟酰胺核糖后,工程菌胞内合成NCD达41.6 μmol/L。对工程菌进行发酵和油脂提取,发现胞内表达NCD合酶未导致细胞产油性能降低,后续可通过表达其他NCD偏好性酶,有望在圆红冬孢酵母中建立受NCD调控的油脂合成代谢体系。 相似文献
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利用多酶级联催化反应合成精细化学品是近年来生物催化领域的研究热点。通过构建体外多酶级联体系,可以替代传统的化学合成法,实现多种双官能团功能化学品的绿色合成。本文系统介绍了多酶级联催化反应中不同级联方式的特点及其构建策略,总结了级联反应中元件酶常用的筛选方法、NAD(P)H和ATP等辅酶的再生策略及其在多酶级联反应中的应用,并且阐述了多酶级联催化反应体系在6种双官能团功能化学品,包括ω-氨基脂肪酸、烷基内酰胺、α,ω-二元羧酸、α,ω-二胺、α,ω-二醇、ω-氨基醇合成中的应用。 相似文献
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微流控芯片技术作为近年来最前沿的分析技术之一,已经在化学、生物学、医药学等研究领域取得了突破性的进展.微流控芯片具有高通量、微型化和多功能集成化等独特优势,已经成为生物医学研究的新平台之一,被越来越多地应用于秀丽隐杆线虫的研究.综述了基于微流控芯片上的秀丽隐杆线虫在生物医学领域中的研究进展,侧重介绍了微流控芯片在线虫的自动化固定、行为学、衰老与发育学、神经学、药物筛选及基因筛选等六大方面所取得的最新进展,并展望了微流控芯片的应用前景. 相似文献
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枯草芽孢杆菌是主要的核黄素工业生产菌之一,高通量筛选技术是选育获得高产核黄素菌株的关键环节。为实现工业菌种选育与高通量筛选技术相结合,对流式细胞分选、液滴微流控分选和96孔板筛选在核黄素工业菌株筛选中的应用进行了研究,并对96孔板筛选方法进行了优化。在流式细胞分析中,来源于同一株工业菌的低产菌株P1与高产菌株R1的细胞荧光与核黄素产量不成正相关。在液滴微流控分析中,P1和R1的发酵液上清荧光与核黄素产量成正相关,然而液滴分选后活细胞的数量很少。在96孔板筛选实验中,振荡培养后P1和R1的发酵液荧光分别为22 264 a.u.、28 647 a.u.;静置培养后荧光分别为7 095 a.u.、10 189 a.u.,核黄素产量与荧光成正相关,且二者荧光差异显著。利用96孔板静置培养的方法对工业菌株S1的突变体库进行筛选,得到的优选菌株核黄素产量为2.53 g/L,相比S1提高了15%。这些结果表明96孔板静置培养-荧光检测筛选可以应用于核黄素工业生产菌产量的提高。 相似文献
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【目的】采用特征次级代谢产物生物合成的保守功能基因探针,定向分离土壤中产生特征次级代谢产物的菌种资源,借助基因转录分析为导向的培养基优化方法,获得目标次生代谢产物。【方法】首先,根据5种特征次级代谢产物保守的合成功能基因设计简并引物,定向从土壤样品中筛选、分离并纯化菌株。然后,以RT-qPCR为指导开展目标产物的发酵培养基优化;最后,对菌株进行发酵,利用多种色谱技术分离纯化目标天然产物,并结合高分辨质谱与核磁共振等技术对所获得的化合物进行结构鉴定。【结果】从土壤中筛选得到了一株AHBA合酶基因和环氧化酶基因均为阳性的链霉菌菌株(编号为CQ01819),根据转录分析优化发酵培养基,最终从该菌株分离纯化得到了含有AHBA结构单元的丝裂霉素C、聚醚类抗生素莫能霉素A和缬吲霉素。【结论】本研究通过菌株的定向分离纯化,筛选得到了产生预期抗生素的浅紫灰链霉菌菌株CQ01819;基于RT-qPCR指导的发酵培养基优化,确定了菌株的发酵条件;获得发酵粗提物后,采用多种色谱整合技术和光谱分析策略,快速分离并鉴定了目标产物。该研究为目标菌种资源的定向筛选、菌株的发酵条件的快速优化和化合物的定向分离提供了较... 相似文献
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体外多酶分子机器遵循所设计的多酶催化路径,将若干种纯化或部分纯化的酶元件进行合理的优化与适配,高效地在体外将特定的底物转化为目标化合物。体外多酶分子机器反应系统呈现元件化和模块化的特点,在设计、组装和调控方面具有较高的自由度。近年来,体外多酶分子机器在实现反应过程的精准调控和提高产品得率方面的优势逐渐体现,展示了其在生物制造领域重要的应用潜力。对体外多酶分子机器的相关研究已成为合成生物学的一个重要分支领域,日益受到广泛的关注。文中系统地综述了基于酶元件/模块的体外多酶分子机器的构建策略,以及改善该分子机器中酶元件/模块之间适配性的研究进展,并分析了该生物制造平台的发展前景与挑战。 相似文献
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固定化脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯 总被引:2,自引:0,他引:2
研究了有机溶剂中脂肪酶催化维生素A棕榈酸酯的合成工艺。采用维生素A醋酸酯和棕榈酸乙酯作为反应底物, 对催化合成维生素A棕榈酸酯反应介质进行了比较, 同时对影响合成维生素A棕榈酸酯反应的因素(温度、初始水含量、底物摩尔比、反应时间和酶量等)进行了探讨, 优化了反应条件: 在10 mL的石油醚中, 体系初始含水量0.2%(体积比V/V), 0.100 g 维生素A醋酸酯和0.433 g 棕榈酸乙酯在酶量为1.1 g的固定化酶催化下, 在30°C、190 r/min下反应12 h, 转化率可以达到83%, 固定化酶可连续使用5次以上。 相似文献
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固定化脂肪酶合成维生素A棕榈酸酯 总被引:3,自引:0,他引:3
研究了有机溶剂中脂肪酶催化维生素A棕榈酸酯的合成工艺。采用维生素A醋酸酯和棕榈酸乙酯作为反应底物, 对催化合成维生素A棕榈酸酯反应介质进行了比较, 同时对影响合成维生素A棕榈酸酯反应的因素(温度、初始水含量、底物摩尔比、反应时间和酶量等)进行了探讨, 优化了反应条件: 在10 mL的石油醚中, 体系初始含水量0.2%(体积比V/V), 0.100 g 维生素A醋酸酯和0.433 g 棕榈酸乙酯在酶量为1.1 g的固定化酶催化下, 在30°C、190 r/min下反应12 h, 转化率可以达到83%, 固定化酶可连续使用5次以上。 相似文献