慢病毒介导的HTRA1 基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立

目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091TC突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。     

miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

构建稳定表达RFP及嘌呤霉素抗性的K562细胞株

目的构建稳定表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）和嘌呤霉素（puromycin）抗性的K562．PM．RFP细胞株,便于慢性粒细胞性白血病研究中K562细胞的观察和筛选。方法采用PCR法获得RFP片段,将其插入到慢病毒pGC-FU-3FLAG-IRES—Puromycin载体中获得pGC—PM—RFP重组质粒,经脂质体转染到293T细胞中获得慢病毒LV—PM—RFP,有限稀释法检测慢病毒在293T细胞中的转染效率,用包装获得的慢病毒感染K562细胞,经嘌呤霉素筛选获得RFP阳性的K562-PM—RFP细胞株。结果PCR及测序结果证实目的基因RFP正确克隆至慢病毒质粒中,经慢病毒LV—PM-RFP感染的K562细胞能在嘌呤霉素抗性培养基中存活,并稳定表达RFP。结论成功构建了慢病毒重组质粒pGC—PM-RFP,并获得了携带RFP及嘌呤霉素抗性基因的K562-PM—RFP细胞株。     

重组人可溶性TIM-3稳转细胞株的构建及其分泌蛋白的表达

该研究通过慢病毒感染的方式构建携带T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3及可结晶区域[T cell immunoglobulin and mucin domain 3 and fragment of crystallizable,TIM-3(Fc)]目的基因的稳定转染细胞株并检测TIM-3(Fc)分泌蛋白的表达。设计特异性引物PCR扩增TIM-3(Fc)片段,重组插入慢病毒表达载体pCD513中并鉴定阳性克隆,无内毒素提取质粒pCD513-TIM-3(Fc)、pSPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,再利用慢病毒感染悬浮HEK293细胞,最后通过嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株293/TIM-3。再通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测TIM-3(Fc)目的基因在转录和翻译水平上的表达,用时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)检测细胞产生TIM-3(Fc)分泌蛋白的能力。成功构建了pCD513-TIM-3(Fc)慢病毒表达载体,qRT-PCR、WB和TRFIA检测表明,293/TIM-3细胞株成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白。成功构建了重组人可溶性TIM-3稳定转染细胞株293/TIM-3并成功表达了TIM-3(Fc)分泌蛋白,为进一步研究可溶性TIM-3蛋白的生物学功能提供基础。     

shRNA沉默CBS基因的慢病毒载体构建及稳定转染PC12细胞系的建立

目的:硫化氢是一种重要的气体信号分子,作为一种神经调质在神经系统中起重要作用。胱硫醚-β-合成酶(CBS)是脑内硫化氢合成的主要酶。构建针对大鼠CBS基因的shRNA干扰载体,稳定转染PC12细胞,观察该载体对PC12细胞CBS基因的沉默效应。方法:构建三条针对大鼠CBS基因的shRNA,经前期实验筛序一条最有效靶点与载体GV248(h U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)连接,经转化及PCR阳性克隆筛选及测序鉴定。将LV-CBS-ShRNA慢病毒载体连同包装载体经脂质体2 000共转染到293T细胞,慢病毒包装后用荧光法进行滴度测定。将包装好的慢病毒转染到PC12细胞,用嘌呤霉素进行筛选,得到稳定转染LV-CBS ShRNA的PC12细胞。实时荧光定量PCR检测CBSmRNA的表达,Western-blot检测CBS蛋白的表达。结果:PCR扩增和测序结果证明,成功构建大鼠LV-CBS ShRNA慢病毒载体,经包装产生的慢病毒滴度为1×109TU/m L。与转染阴性对照慢病毒(LV-NC-ShRNA)的细胞比较,LV-CBS ShRNA慢病毒转染可使PC12的CBSmRNA和CBS蛋白表达分别下降51.2%和48%。成功构建CBS基因ShRNA干扰的PC12细胞株,为后续研究CBS在神经系统中的作用奠定基础。     

人Hes1-shRNA，Hes5-shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人Hesl-shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,为Notch—Hes信号通路的相关研究奠定基础。方法根据人Hes1,Hes5基因mRNA序列分别设计、合成多对互补的DNA单链寡核苷酸,退火后克隆至pENTR／U6入门载体。通过入门载体瞬时转染神经胶质瘤U251细胞筛选有效干扰序列。将含有效干扰序列的入门载体与pLenti6／BLOCK—iT—DEST载体进行LR重组构建Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体,经脂质体介导入293FT细胞,包装成慢病毒。用该慢病毒感染U251细胞,Western印迹法分别检测Hes1,Hes5蛋白的表达。结果分别构建了针对Hes1和Hes5基因的特异性shRNA慢病毒表达载体,其包装获得慢病毒可有效感染U251细胞并分别对HeM,Hes5蛋白的表达有显著抑制作用。结论成功构建了Hesl—shRNA和Hes5-shRNA慢病毒表达载体。     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

copGFP和PuroR双标记基因慢病毒融合表达载体的构建及应用*

目的: 构建具有绿色荧光蛋白(copGFP)和嘌呤霉素抗性基因(PuroR)融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,检测其嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性。方法: 从pCDH-CMV-MCS-copGFP载体中扩增copGFP编码区DNA序列,从pLKO.1载体中扩增Puro^R编码区DNA序列,运用重组PCR方法,扩增copGFP与Puro^R基因融合编码序列并克隆至经BamH Ⅰ+Sal Ⅰ双酶切的pCDH-CMV-MCS-copGFP载体片段中,构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;载体的融合标签序列进行测序确证;将该载体用辅助包装质粒PLP1、PLP2、VSVG在293T细胞中包装成慢病毒后感染肝癌细胞MHCC97H,检测感染细胞对嘌呤霉素的抵抗作用以及绿色荧光蛋白的表达情况;为验证该载体表达外源目的基因的有效性,将Sp1编码区DNA序列插入该载体中包装成慢病毒,用对照及表达Sp1的慢病毒感染肝癌细胞MHCC97H,感染细胞经1 mg/ml嘌呤霉素筛选7 d后获得稳定感染细胞株,提取稳定感染细胞的总RNA及总蛋白,分别运用RT-qPCR和Western blot方法检测Sp1在对照及表达Sp1的慢病毒感染的肝癌MHCC97H细胞中的mRNA和蛋白表达水平的差异。结果: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;该载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,感染细胞同时具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光蛋白特性;将Sp1编码序列插入该载体,包装慢病毒并肝癌细胞,Sp1 的mRNA水平对照细胞相比分别升高3.3倍,蛋白水平升高2.2倍(P＜0.01)。 结论: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,该载体编码的融合双标记基因具有嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性,可高水平表达长片段的目的基因。     

稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。     

在表达HCV Core蛋白的肝癌细胞中建立Notch1低表达稳定转染细胞株

目的筛选并包装Notch1基因shRNA低表达的慢病毒,感染稳定表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白(core)的肝癌细胞,在此基础上建立低表达Notch1基因的SMMC7721-Core稳定转染细胞株。方法设计针对Notch1基因mRNA的干扰序列,并将其连接入载体质粒,转染HEK293T细胞,构建带有Notch1基因的慢病毒表达载体,感染稳定表达HCV Core蛋白的人肝癌细胞株SMMC7721-Core,采用定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)和免疫印迹法(Western blot)检测干扰效果。结果构建了带有干扰Notch1基因的慢病毒表达载体,感染SMMC7721-Core细胞后筛选获得稳转细胞株,qPCR测得Notch1 mRNA低表达,Western blot检测到Notch1蛋白低表达。结论成功构建了Notch1低表达SMMC7721-Core人肝癌稳定转染细胞株,为进一步开展对HCV Core蛋白诱导肝癌过程中Notch1所起作用的研究提供了依据。     

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建丝/苏氨酸蛋白激酶2（AKT2）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法：利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果：成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论：成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

慢病毒GV115-AIF siRNA 重组表达系统的构建及鉴定

目的:构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。方法:根据目的基因AIF以及RNA干扰序列设计原则,利用设计软件设计了3个可能的AIF si RNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-AIF si RNA重组质粒,并采用聚合酶链反应技术(PCR技术)和基因测序技术对GV115-AIF si RNA重组质粒鉴定。利用GV115病毒包装辅助p Helper 1.0质粒和p Helper 2.0质粒进行病毒包装。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用逆转录定量PCR技术(RT-PCR技术)检测转染后对人胚肾293T细胞中AIF基因的敲减效率,筛选最高效的AIF si RNA基因序列。结果:GV115-AIF si RNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。3个可能的AIF si RNA序列中基因敲减效率最高的可达到88.3%。结论:成功构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。     

Nr4a2过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建含Nr4a2基因的绿色荧光慢病毒载体,并检测其体外表达目的基因的水平。方法:设计Nr4a2基因的引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增,插入经AgeⅠ/AgeⅠ酶切的GV287慢病毒载体构建GV287-Nr4a2慢病毒质粒。PCR鉴定、测序验证后,将其与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体共同转染293T细胞(人胚肾细胞),48小时后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,经浓缩并测定滴度后感染293T细胞,72h后观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组慢病毒载体GV287-Nr4a2;荧光显微镜下可见绿色荧光高度表达;Nr4a2蛋白能在293T细胞中有效表达;包装过表达慢病毒并测其浓缩滴度为2.0×108TU/ML。结论:成功构建Nr4a2慢病毒载体且在293T细胞中良好表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞,基因治疗帕金森病奠定基础。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

慢病毒载体沉默ADAMTS6人非小细胞肺癌稳转株的构建

目的:通过数据库预测ADAMTS6在非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC患者临床预后的关系,构建ADAMTS6的shRNA干扰载体并建立ADMATS6的NSCLC稳定敲减细胞株。方法:通过Oncomine数据库分析ADAMTS6在NSCLC组织和肺正常组织的表达差异,通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析ADAMTS6的表达水平与临床NSCLC患者预后关系,设计合成ADAMTS6的shRNA干扰序列,shRNA模板退火并与双酶切pGLV3-GFP线性化载体连接,转化挑取阳性菌落后送测序。干扰质粒进行病毒包装并感染人NSCLC细胞株NCI-H358,使用嘌呤霉素进行稳定敲减细胞株筛选。荧光观察慢病毒感染细胞密度,通过qRT-PCR和Western blot检测ADAMTS6的mRNA和蛋白水平的敲减效果。结果:Oncomine数据库分析结果显示NSCLC组织中ADAMTS6 mRNA表达较正常肺组织显著升高(P0.001);Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示高表达ADAMTS6的NSCLC患者预后较低表达ADAMTS6的NSCLC患者差(P0.05);pGLV3-GFP载体双酶切线性化后与shRNA退火模板连接成功,测序结果正确。荧光观察显示慢病毒感染细胞密度在95%左右,通过qRT-PCR和Western blot检测ADAMTS6慢病毒干扰质粒已成功敲减ADAMTS6的m RNA和蛋白水平。结论:ADAMTS6的高表达可能与NSCLC患者的不良临床预后密切相关。本研究构建了ADAMTS6的慢病毒感染质粒,并成功建立NCI-H358稳定敲减细胞株,为进一步研究ADAMTS6在NSCLC中的作用及机制奠定了基础。     

携带荧光素酶基因肝癌细胞株的构建及在肝癌原位移植瘤模型中应用

[目的]构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞株,建立可实时观察的肝癌原位移植瘤模型。[方法]构建含有萤光素酶基因的慢病毒载体,利用慢病毒三质粒系统磷酸钙共转染HEK 293T细胞,收集纯化病毒感染肝癌细胞SMMC7721,嘌呤霉素(puromycin)结合有限稀释法筛选稳定转导细胞株,将细胞原位注射裸鼠肝组织,建立原位肝癌动物模型。[结果]包装纯化的慢病毒悬液的滴度为8.4×106TU/m L,感染肝癌细胞后成功筛选到稳定表达的肝癌细胞株。利用该细胞株成功建立原位注射肝癌裸鼠模型,经活体荧光成像系统观察到肝癌细胞在活体动物体内的分布情况。[结论]荧光素酶肝癌细胞株的成功构建及利用该细胞株建立的原位移植瘤肝癌动物模型为肝癌的治疗研究奠定了基础。