丙酮丁醇梭菌的基因编辑工具及代谢工程改造

丙酮丁醇梭菌作为极具潜力的新型生物燃料丁醇的生产菌,受到各国研究学者的广泛关注。通过丙酮丁醇梭菌(ABE)发酵生产丁醇,由于生产成本高,限制了其工业化应用。随着基因组学和分子生物学的快速发展,适用于丙酮丁醇的基因编辑工具不断发展并应用于提高菌株的发酵性能。本文对丙酮丁醇梭菌基因编辑工具和代谢工程改造取得的进展进行综述。     

糖丁基梭菌产丁醇途径在大肠杆菌中的构建及发酵

摘要:【目的】通过克隆来源于糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum DSM13864)丁醇合成途径的关键酶基因(thlA,bcs-operon和adhE),构建产丁醇大肠杆菌。【方法】以Clostridium saccharobutylicum DSM13864的基因组为模板,分别扩增丁醇途径关键酶基因thlA,bcs-operon(crt-bcd1-etfB2-fixB2-hbd)和adhE,构建了两个重组质粒pETDuet-bcs和pRSFDuet-thlA-adhE,并成功转入E.coli JM109(DE3)实现异源表达,使大肠杆菌具备产丁醇能力。在半厌氧条件下进行重组菌的发酵,并研究不同培养基对产丁醇的影响。【结果】该重组菌在半厌氧条件下经摇瓶发酵丁醇产量达到25.4 mg/L,通过优化培养基后,在TB发酵培养基中丁醇产量可达到34.1 mg/L。【结论】通过构建重组共表达质粒,将糖丁基梭菌来源的丁醇途径关键酶基因在大肠杆菌中表达,成功构建产丁醇大肠杆菌。该研究提供了一株易于操作的丁醇发酵重组大肠杆菌,避免了传统梭菌发酵丁醇生产中苛刻的厌氧条件、易产孢子等限制问题。     

细胞分裂蛋白编码基因的敲除对丙酮丁醇梭菌溶剂合成与细胞形态的影响

丙酮丁醇梭菌是生物丁醇合成的重要菌株,近年来,研究者们利用基因编辑等技术对其进行菌株改造。通过对丙酮丁醇梭菌中3个细胞分裂蛋白(RodA、DivIVA、DivIB)编码基因(cac1251、cac2118、cac2125)进行敲除,发现cac2118敲除菌株的细胞在产溶剂期为球状形态,细胞变小,ABE发酵的丁醇得率为0.19 g/g,与野生型相比提高了5.6%。cac1251敲除菌株的葡萄糖消耗量和丁醇产量与野生型相比降低了33.9%和56.3%,分别为47.3 g/L和5.6 g/L。cac1251和cac2125的敲除对细胞生长有显著影响,菌体浓度最大值与野生型相比分别降低了40.4%和38.3%。研究表明细胞分裂蛋白DivIVA对细胞的形态和大小调控起重要作用;细胞分裂蛋白RodA和DivIB调控细胞分裂进程,进而影响细胞生长和溶剂合成进程。     

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)原生质体融合育种研究

为了提高丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丁醇耐受能力和培养基总糖产丁醇的转化率,通过原生质体融合的方法,研究了溶菌酶浓度及其作用时间、再生培养基种类、55℃条件下菌体致死时间、不同PEG分子量以及作用时间、Ca^2+和Mg^2+不同的添加量对丙酮丁醇梭菌原生质体制备、融合、再生的影响,得到了一套比较系统的丙酮丁醇梭菌的原生质体融合条件,同时通过气相色谱检测了融合菌的产溶剂能力并计算总糖转化率。结果显示,最终得到的215I菌株的总糖转化率比原始菌株提高了34.7%,产丁醇能力比原始菌株提高了32.2%,并且发现1株融合菌能产生新物质。原生质体融合方法在丙酸丁醇梭菌育种方面有广泛的应用潜力,通过融合得到的菌株为丁醇生产奠定了基础。     

丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造

丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌是重要的ABE（丙酮、丁醇和乙醇）工业生产菌株,其发酵产物中的丙酮和丁醇均为重要的化工原料,汽车发动机试验证明丁醇还是一种性能优于乙醇的极具潜力的生物燃料和燃料添加剂。随着新生物技术的不断发展及工业生产的需求,遗传工程改造不断应用于丙酮丁醇生产菌株。在前人研究及工业实践的基础上,对丙酮丁醇生产菌株的遗传特性及其分子遗传改造取得的进展进行了详细概述。     

丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统

丙酮丁醇梭菌是极具潜力的替代燃料——生物丁醇的合成菌,受到各国研究者的普遍关注。丙酮丁醇梭菌菌株改造是生物丁醇产业化进程中的一项重要工作,其中遗传操作是核心内容之一。以下对丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统的发展历史、种类和原理进行了综述,分析了目前几种遗传操作系统的局限性,并对其发展进行了展望。     

产溶剂梭菌分子遗传操作技术研究进展

产溶剂梭菌是一类重要的工业微生物.通过遗传改造以优化产溶剂梭菌的发酵性能一直是溶剂制造技术研究的重要课题,但长期受限于该类菌并不完善的遗传操作工具,未见明显突破.近年来,随着TargeTron基因中断、大片段基因整合等新技术和新方法的出现,其分子遗传改造已取得较大进展.文中对产溶剂梭菌的分子遗传操作工具研究进展进行了总结,并指出了现有技术在效率及全面性方面的不足.基于此,今后应进一步优化现有的梭菌基因失活技术,如建立基于同源重组的基因删除和替换;同时也应发展新的分子操作技术,如基因组多位点共编辑、多拷贝定点和随机整合等.     

生物丁醇发酵研究进展

随着化石燃料的枯竭及环境污染的日趋严重,生物燃料等清洁可再生能源已成为世界各国研究开发的热点。生物丁醇以其燃烧值高,能量密度大,污染轻,以及可与汽油以任意比例互溶等特点,成为新一代可再生资源研究开发的重点。尽管生物丁醇目前前景广阔,但传统丙酮-丁醇-乙醇(Acetone-butanol-ethanol,ABE)发酵途径生产成本高且产率低限制了其商业化生产。为了有效降低原材料成本,实现廉价生物材料的工业转换,基于生物质资源的经济型发酵工艺成为研究热点;通过外源添加的技术手段,快速揭示发酵体系下菌株表型及发酵性能变化对于系统阐述菌株代谢水平与基因水平交叉作用规律具有一定理论意义。此外,随着全基因组测序及相关组学工程技术手段的发展,围绕代谢网络结构改造,阻断非丁醇代谢合成通路,明确胁迫调控机制,解除相关代谢调控等方面内容,对产丁醇梭菌进行内源改造,以期提高丁醇代谢合成能力及丁醇耐受性的研究也逐步深入。基于丁醇发酵生物质资源开发,代谢宏观调控策略及菌种选育等方面研究进展,讨论了生物丁醇生产代谢过程中的瓶颈问题,并对生物丁醇发展前景进行展望,旨为工程菌的构建和基于过程工程技术的代谢调控提供理论依据。     

丁醇基因在大肠杆菌中表达的现状与展望

随着化石能源过度开采带来的能源短缺与环境恶化,丁醇凭借着其优越的理化性质成为了最具潜力的绿色燃料之一。近几年微生物在生物能源生产研究中受到广泛关注,主要集中在梭菌丁醇合成途径的异源表达。目前利用大肠杆菌产丁醇的产量已经接近产丁醇的天然菌株的产量。然而,大肠杆菌产丁醇仍存在很多限制性因素。主要从乙酰辅酶A依赖途径评述大肠杆菌生产丁醇的限制因素,并讨论提高丁醇产量需要解决的问题。     

丁醇产生菌育种研究进展

生物丁醇产业因发酵法的产量、产率和比例低等原因受到限制。菌种改良是解决问题的一个重要和根本的策略。诱变育种仍然是工业育种的主要方法,复合诱变和理性化筛选更有效。基因工程育种对丙酮丁醇梭菌和大肠杆菌丁醇合成途径进行改造和构建优化,还可改造途径外影响合成的其它基因,以获得高产菌株,发展最为迅猛,但效果仍低于诱变育种。今后的菌种改良方向仍为提高产量和比例。     

丙酮丁醇梭菌丁醇耐受性

丁醇在发酵培养基中的积累所产生的毒性问题是限制丁醇产量的重要因素,然而对于Clostridium acetobutylicum是如何适应丁醇胁迫,进而调节菌体生长和代谢的,目前尚缺乏系统研究,不能全面揭示C.acetobutylicum的丁醇耐受性机制.对丙酮丁醇梭菌丁醇耐受性有关的研究成果进行了综述,旨在深入理解菌株丁醇耐受性发生改变的相关分子基础.希望为进行微生物丁醇耐受性分子机制的改造、提高菌株的丁醇耐受性提供新的研究思路.     

重组丙酮丁醇梭菌的构建及其木质纤维素ABE发酵

[目的]提高丙酮丁醇梭菌降解利用纤维素原料的能力。[方法]将甲基化的重组表达载体p SOS95-cel9电转化至丙酮丁醇梭菌ATCC824。[结果]成功构建重组菌株ATCC824/p SOS95-cel9。通过荧光定量PCR检验到外源纤维素酶基因cel9在重组丙丁梭菌中的转录,24 h的相对表达量是12 h的27. 1倍。重组菌ATCC824/p SOS95-cel9发酵滤纸产丙酮0. 05 g/L、丁醇0. 08 g/L、乙醇0. 71 g/L,发酵蔗渣水解液产0. 78 g/L、1. 09 g/L、0. 97 g/L,各溶剂产量均显著高于空质粒对照菌株。[结论]重组菌能利用滤纸及蔗渣水解液进行ABE发酵,外源纤维素酶基因cel9的重组表达提高了工程菌株利用纤维素原料的能力。     

丁酸梭菌及产丁酸代谢改造

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是一种专性厌氧菌,可通过多基因过表达、同源重组、基于非复制型质粒和非复制型质粒的同源重组等多种遗传操作方式对其进行改造。丁酸是丁酸梭菌发酵的产物之一,丁酸用途广泛,用于饲料添加剂,可提高动物抵抗力,减少抗生素的使用。用丁酸梭菌发酵产丁酸,其产量仍然较低,不利于工业化生产,有必要通过代谢工程对丁酸梭菌产丁酸的途径进行优化。对丁酸梭菌的主要代谢途径、遗传操作体系及丁酸合成途径的优化等研究进展进行了综述。在此基础上,对丁酸梭菌进一步改造的思路和想法进行了展望。     

木薯发酵产丁醇的研究

对丙酮丁醇梭菌发酵木薯产溶剂进行研究,分别考察了N源、木薯含量、酶处理条件和培养基pH对发酵产丁醇的影响。结果表明：最佳的产丁醇发酵培养基为木薯粉120g／L,乙酸铵6g／L;木薯粉先用高温淀粉酶按酶量20U／g、90℃水解60min,再糊化30min;发酵初始pH为6．0,发酵96h。在此条件下,5L发酵罐中丁醇产量达到13．5g／L,总溶剂达到22．8g／L。     

利用Tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丁醇生产水平

目前,对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作,主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力,需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因,但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株实验室前期构建的产丁醇大肠杆菌工程菌株为研究对象,利用Tn5转座子构建了一个含有1 196个菌株的突变文库。丙酮酸是丁醇的前体,并且在发酵终产物中,副产物丙酮酸的含量与丁醇的含量呈反相关,因此,可以利用丙酮酸的含量来间接反映丁醇的含量,而丙酮酸可用二硝基苯肼显色法进行快速测定,基于此,建立了96孔板——酶标仪快速筛选方法。利用该方法成功筛选到了比对照菌株丁醇产量提高了29%、49%、56%的3个突变体菌株。利用反向PCR及测序的方法,确定了其转座子插入位置分别为:pyk A、tdk、cad C基因。这些基因可以作为进一步提高菌株丁醇产量的靶点,同时这种利用Tn5转座子筛选基因靶标的策略也为构建其他微生物细胞工厂提供了新思路。     

丙酮丁醇梭菌发酵产溶剂的进展

丁醇是大宗基础化工原料,可由产溶剂梭菌发酵可再生原料生产,并有望成为新一代生物燃料.协作组在国内率先开展了改进溶剂发酵菌种生产性能的实验研究,通过土样筛选和诱变选育获得一株高丁醇比例的丙酮丁醇梭菌EA2018(中国发明专利CN1143677A),丁醇比例比常规生产菌株高10%,达到70%.该菌株于20 世纪90 年代成功在河北冀州和山东泗水得到工业化应用,近年又许可给河南天冠集团与吉林吉安新能源集团用于规模生产.     

丙酮丁醇梭菌磷酸化蛋白质组分析

近年的研究揭示,细菌细胞中蛋白质的磷酸化状态可能调节信号或代谢通路的生物活性。丙酮丁醇梭菌是一个重要的工业菌株,在酸性条件下能够生成大量的有机溶剂。然而,调节丙酮丁醇梭菌有机溶剂生成的分子机制尚未完全阐明。采用双向电泳和质谱联用的技术,比较了该菌在产酸期与产有机溶剂期间的差异蛋白质谱图。特别关注了那些分子量接近但具有不同等电点的蛋白质。在高有机溶剂生成速率的丙酮丁醇梭菌中,发现了8个电泳斑点簇呈现明显的酸移而且伴随光密度强度的变化。质谱分析数据表明,这些蛋白质均含有磷酸化修饰的肽段。生物信息学分析预示,这些蛋白质参与了有机溶剂的生成过程。但究竟它们的磷酸化状态如何调控有机溶剂生成仍需更为深入地研究。     

典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展

以解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)和热纤梭菌(Clostridium thermocellum)为代表的产纤维小体梭菌可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化,是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌株。然而,这些产纤维小体梭菌的纤维素降解效率及乙醇产量尚不能满足工业化生产的要求,其遗传改造技术的不成熟严重制约了通过定向代谢工程改造提高生产性能的进程。针对这些典型的产纤维小体菌株,各国科学家近年来在基于二类内含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台建立方面取得了较大突破,并通过靶向代谢工程改造,显著提高纤维素乙醇的产量。笔者对这些前期研究工作以及国内外相关研究成果进行系统的总结,并对构建的遗传改造工具的应用前景进行展望。     

典型产纤维小体梭菌的遗传改造及其在纤维素乙醇中的应用研究进展简

以解纤维梭菌（ Clostridium cellulolyticum）和热纤梭菌（ Clostridium thermocellum）为代表的产纤维小体梭菌可以直接完成从木质纤维素原料到乙醇的生物转化,是用于通过整合生物加工技术生产纤维素乙醇的优良候选菌株。然而,这些产纤维小体梭菌的纤维素降解效率及乙醇产量尚不能满足工业化生产的要求,其遗传改造技术的不成熟严重制约了通过定向代谢工程改造提高生产性能的进程。针对这些典型的产纤维小体菌株,各国科学家近年来在基于二类内含子的嗜中温及嗜高温遗传改造平台建立方面取得了较大突破,并通过靶向代谢工程改造,显著提高纤维素乙醇的产量。笔者对这些前期研究工作以及国内外相关研究成果进行系统的总结,并对构建的遗传改造工具的应用前景进行展望。     

丁酸胁迫耦联丙酮丁醇梭菌-酿酒酵母混合培养强化丁醇发酵性能

为改善丁醇发酵性能,提出丁酸胁迫与丙酮丁醇梭菌-酿酒酵母混合培养体系协同作用的新型丁醇发酵优化控制策略.7L发酵罐中,在溶剂生产期(24 h)添加4.0 g/L-broth的丁酸浓缩液和0.2 g-DCW/L-broth的酿酒酵母进行发酵,丁醇浓度、丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率与对照相比分别提高35％、43％和79％,达到15.74 g/L、2.83和0.52 g/L/h的最高水平.若将精馏后溶剂混合物作为高效柴油添加剂,柴油添加剂中B∶A∶E比例可达74∶17∶9(w/w)的高水平,产品质量获得显著改善.试验及分析阐明该优化控制策略可大幅诱发赖氨酸的分泌及在梭菌中的吸收/利用,提高梭菌对高丁醇浓度环境的耐受能力,促进丁醇合成;可强化梭菌对底物利用的竞争能力、提高电子往复穿梭传递系统中还原力再生速率、产生更多用于丁醇合成的NADH.两者的协同作用大幅提高了丁醇发酵的整体性能.