用透性化细胞技术合成海藻糖

建立了一种渗透处理微球菌细胞的方法,得到的透性化细胞可多批使用并能长时间保持胞内酶的活力,极大地提高了单位菌体的利用率,降低了成本,为海藻糖实现工业化开辟了新的思路。实验结果表明:菌悬液用5％(v/v)甲苯处理40min,得到的菌体即为透性化细胞,再以10％淀粉液化液为底物进行海藻糖转化实验,转化率可达70％;该透性化细胞至少可连续进行6批酶反应(12h/批),酶活基本保持稳定。     

细胞透性化技术及其应用

细胞透性化技术可以在不破坏细胞整体有机体系的情况下改变细胞膜的通透性,从而克服细胞膜的渗透屏障,降低胞外物质的传质阻力,使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用,从而提高其稳定性和催化效率.细胞透性化技术方法简便,在提高固定化细胞生物转化效率以及胞内酶的原位分析等方面有着广泛的应用.本文将简要介绍细胞透性化技术的概念、处理方法及其应用情况.     

基于海泡石的细胞透性化

利用矿石纳米材料海泡石处理大肠杆菌细胞,建立高效、可逆透性化处理方法。结果表明:海泡石和大肠杆菌BW25113细胞悬液涡旋振荡,细胞通透性增强,90%以上的细胞因渗入博莱霉素致死;而在4℃修复处理过的样品,仅23%的细胞被杀死。发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)进出透性化细胞的能力与胞内外NAD浓度梯度正相关。该可逆透性化方法对生物催化和药物递送等研究具有重要价值。     

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。     

L-茶氨酸新型酶法制备及其催化工艺优化

L-茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主要组成部分,关于其良好的生理活性已有广泛报道。首次报道了来源于Cunnighamella echinulata 9980的L-氨基酰化酶用于高光学纯度的L-茶氨酸的酶法制备。该酶在pH 6.5,底物N-乙酰-DL-茶氨酸浓度为50 mM,且有40 mM CoCl2时催化效果较好。结果表明,在上述条件下,50℃作用12 h得L-茶氨酸22.5 mM,转化率90%。     

全细胞催化合成阿糖胞苷工艺的研究

以阿糖尿苷和胞嘧啶为原料,采用枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis A302作为全细胞催化剂进行阿糖胞苷的生物合成,通过单因素与正交试验的考察,得到了全细胞催化合成阿糖胞苷的最佳反应条件:反应初始pH为7.0,反应温度为36℃,催化剂添加量为250 mg,摇床转速为190 rpm,该条件得到的阿糖胞苷收率达到65.3％.该方法操作简单,反应体系杂质较少,是合成阿糖胞苷的一种有效可行的方法.     

昆虫海藻糖及其合成酶基因的特性与功能研究进展

海藻糖广泛存在于细菌、真菌、昆虫、无脊椎动物和植物等大量生物中。它不仅可以作为昆虫的能量来源,而且在抗逆等方面起着重要作用。海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的一个关键酶。目前细菌、真菌和植物中都已经被发现和克隆,但其不存在于哺乳动物中。海藻糖是昆虫的"血糖",主要通过海藻糖合成酶和海藻糖-6-磷酸脂酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)在脂肪体中催化合成。TPS基因所编码的蛋白序列一般都包含两个保守的结构域:TPS和TPP,分别对应着酵母中的Ots A和Ots B基因。昆虫海藻糖合成酶的基因表达和酶活性的变化与昆虫的多项生理过程有着密切的关系,海藻糖合成酶有可能成为控制害虫的新靶标。     

灰树花海藻糖合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

海藻糖主要作用是作为生物体的结构组分、以及保护生物膜和保护蛋白质。在灰树花中 ,海藻糖在干重中所占比例最高可达到 1 5 %～ 1 7% ,说明灰树花合成海藻糖的能力很强。将灰树花海藻糖合成酶基因克隆 ,并在大肠杆菌表达系统里表达。表达量为 1 90mg L。通过活性测定 ,证明在大肠杆菌中表达的海藻糖合成酶具有酶活性 ,结合基因工程和酶工程方法 ,为合成海藻糖的研究提供了新的方向     

海藻糖的生产制备及其应用前景

海藻糖是一种广泛分布于细菌、真菌和动植物体内的双糖。在生物体内 ,它不仅作为结构成分和能量物质存在 ,而且在热击和脱水等协迫条件下 ,对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用。由于其独特的生物学功能 ,它在食品、分子生物学、医药、化妆品、农业等方面具有广阔的应用前景。简述海藻糖的生产制备、应用研究及其前景展望。     

大肠杆菌海藻糖合成酶基因的克隆和表达

利用Ｍｕ转座子细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶 ｏｔｓＢＡ基因,克隆频率为１．４５ ｘ １０(－３)／ Ｋａｎ(ｒ)转导子。经遗传互补、酶切和部分序列分析表明ｏｔｓＢＡ基因位于克隆质粒。亚克隆 ２．８７ｋｂ ＤＮＡ片段至不同拷贝数表达质粒并分别转化大肠杆菌ｏｔｓＢＡ基因缺失株,转化株恢复 在０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ培养基上生长的功能,高渗透压诱导实验表明,转化株能够合成克隆基因 产物海藻糖,但合成量不受克隆质粒拷贝数影响。海藻糖良好的抗高渗能力可能在农作物育 种方面发挥重要作用。为构建含有海藻糖合成酶基因的植物表达载体,并在农杆菌的介导下 转入植物,赋予其抗高渗、耐干旱能力奠定了重要的研究基础。     

一株海藻糖合成酶产生菌的鉴定及产酶条件优化

目的对一株海洋来源的产海藻糖合成酶菌株进行鉴定及产酶条件的初步优化。方法通过16SrDNA基因序列的同源性分析,对一株来源于东海海水的海藻糖合成酶产生菌进行鉴定,并通过单因素分析初步研究其培养特性和最佳的发酵条件。结果该菌16SrDNA序列与GenBank中已知序列相比,最高相似度为100％,鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）,命名为Pseudomonassp．A50。其最佳碳源和氮源分别为2％麦芽糖和0．5％酵母膏,最佳NaCl浓度为2．5％,在初始pH7．8,接种量1％,装液量125mL／250mL,28℃,130r／min发酵48h,海藻糖合成酶活力达到最高。结论此产海藻糖合成酶菌株为假单胞菌属,优化后,海藻糖合成酶活力达到14．16U／mL。     

佛波醇制备工艺优化及其衍生物的合成表征与细胞毒活性研究

目前佛波醇制备过程比较繁琐,本研究首先对制备工艺进行优化,使制备周期缩短至3天。然后以佛波醇、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、花生酸为原料,设计合成了18个新化合物,运用1H NMR,13C NMR,HR-MS对化合物进行结构表征,并测试了这些化合物对人正常胚肺成纤维细胞(MRC-5)的毒性。结果显示13个化合物对正常细胞毒性较大(IC50<38.12μmol/L),5个化合物毒性较小(IC50> 100μmol/L)。佛波醇的12位羟基、13位羟基分别与长链饱和脂肪酸形成单酯时毒性较低,实验结果为佛波醇的结构修饰提供参考。     

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度,4～28℃保温,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短,在5min内即可完成。同时,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。     

亚栖热菌透性化细胞的耦合固定化研究

将海藻酸盐凝胶包埋法与交联法和聚电解质静电自组装覆膜法相耦合,对含有海藻糖合酶活性的亚栖热菌的透性化细胞进行了固定化研究。结果表明,利用重氮树脂和聚苯乙烯磺酸钠对海藻酸凝胶微球交替覆膜,可以显著提高凝胶微球在磷酸盐缓冲液中的稳定性,以碳二亚胺对固定化细胞进行交联处理则可以提高固定化细胞中海藻糖合酶的热稳定性。透性化细胞经包埋－交联－覆膜耦合固定化后,酶活回收率为32％,最适酶反应pH值由6.5左右升至7.0左右,最适反应温度未变,仍为60℃。所得固定化细胞间歇反应时,催化麦芽糖转化为海藻糖的转化率可达60％,重复使用4次（每次50℃、反应24h）,酶活损失小于20％,转化率可保持在50％以上。     

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶表达质粒的构建及诱导条件优化

采用PCR方法从Pseudomonas putida S1中克隆出编码海藻糖合成酶的基因treS,并与质粒pQE30T相连,构建了表达质粒pQE—TS2。将此重组质粒转化宿主菌E．coliM15进行诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶SDS—PAGE电泳结果表明,treS基因在大肠杆菌中获得了高效表达。通过对诱导温度、诱导剂浓度、加诱导剂时间和诱导时间的优化研究,在菌液生长至OD600值为0．6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0．01mmol／L,20℃诱导20h,蛋白的表达量达到每克干细胞89mg的蛋白,粗酶液酶活达到19U／mL。     

一株产海藻糖合成酶极地细菌的鉴定

从来源于极地的微生物中筛选得到一株产海藻糖合成酶的耐冷细菌S1,通过形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定该菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。     

非核糖体肽合成酶催化模块的重构与多肽合成

天然次级代谢产物是重要的药物来源,非核糖体肽(non-ribosomal peptide, NRP)是自然界中广泛存在的次级代谢产物,其多样的化学结构使其具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒等。基于非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPS)模块化线性合成多肽的原理对其催化模块进行改造、重组,定向设计多肽的生物合成途径以获得目的多肽已成为一个研究热点。然而杂合NRPS存在催化模块无法加载目标氨基酸或多肽合成效率显著降低等诸多问题,限制了其应用。近年来,NRPS腺苷酰化域(adenylation domain, A域)及缩合结构域(condensation domain, C域)的底物选择性、NRPS亚基间对接域(docking domain, DD)和模块间连接区(linker)的研究已取得较大突破。从C域对底物的选择性及以不同融合边界进行催化单元替换两方面进行综述,介绍NRPS催化模块重构的研究进展,并概述了各替换方案的优点与局限性。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因的表达特性及其在糖代谢调控中的作用

【目的】昆虫中海藻糖主要通过海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)在脂肪体中合成,当昆虫受极端环境胁迫时TPS能够诱导海藻糖累积从而起到保护作用。本研究旨在分析白背飞虱Sogatella furcifera两个TPS基因的发育和组织表达模式及其对糖类物质代谢调控功能,探究TPS基因在白背飞虱生长发育中的具体作用。【方法】基于实验室前期获得的两个海藻糖合成酶基因SfTPS1和SfTPS2片段序列,在本实验中也进行了基因克隆和测序筛选,比对两者确定了白背飞虱两个TPS基因序列。并通过MEGA 7.0软件构建基于氨基酸序列的白背飞虱与其他昆虫TPS的系统发育树。利用qRT-PCR技术检测这两个基因在白背飞虱不同发育阶段(4龄第1天若虫至3日龄成虫)和成虫不同组织(头、足、翅、中肠、脂肪体、表皮和马氏管)中的表达情况。合成这两个基因的dsRNA,并注射到白背飞虱5龄第1天若虫中进行RNAi。在RNAi 48和72 h后检测白背飞虱海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2和TRE2的表达变化,海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】克隆获得白背飞虱SfTPS1和SfTPS2,ORF分别为2 424和2 115 bp,编码氨基酸数目分别为807个和704个,预测蛋白质分子量分别为90.37和80.56 kD,等电点分别为6.08和6.10。而且白背飞虱2个TPS氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens TPS1和TPS2的一致性最高。发育阶段表达模式表明,白背飞虱TPS基因SfTPS1和SfTPS2在4龄若虫到成虫阶段都有表达;组织表达模式表明,SfTPS1和SfTPS2在成虫马氏管、中肠和表皮中的表达较为显著。当SfTPS1被RNAi后,TRE1-1和TRE2的表达水平与对照组(dsGFP注射组)相比分别为略有上升和显著升高,TRE1-2的相对表达水平在SfTPS1被RNAi 48 h后显著上升而在72 h后显著下降;可溶性海藻糖酶活性无显著变化,膜结合型海藻糖酶活性显著增加;白背飞虱5龄若虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。TRE1-2和TRE2基因的表达水平在SfTPS2被RNAi 48 h后显著升高,而在72 h后两基因的表达水平却显著下降;TRE1-1基因的表达水平在注射dsSfTPS2 48和72 h后均显著上升。可溶性海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 48 h后显著下降,72 h后显著上升;膜结合型海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 72 h后显著增加。白背飞虱5龄若虫体内葡萄糖含量在SfTPS2基因RNAi 48 h后显著减少,但在72 h后海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。【结论】通过调节白背飞虱体内TPS基因的表达影响TRE1-1,TRE1-2及TRE2基因的表达水平,进而调控体内海藻糖的含量,该结果为后期采用TPS为靶标基因用于害虫防治提供理论依据。