CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响

目的:研究人类肿瘤相关基因CHD5基因miR-shRNA慢病毒对结直肠癌Lovo细胞的影响。方法:利用软件设计对CHD5基因干扰有效的序列,合成靶序列,退火形成双链DNA,酶切后与载体相连接。将重组慢病毒载体pPRIME-TET-GFP-CHD5与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G,pRSV-Rev,pMDLg-pRRE共转染293FT细胞,将包装重组慢病毒感染人类结直肠癌Lovo细胞。通过荧光定量PCR和Western blot验证CHD5基因在细胞中的表达情况,应用MTT检测CHD5低表达对Lovo细胞增殖的影响。结果:成功构建pPRIME-TET-GFP-CHD5重组质粒,经酶切及序列测定正确,包装的病毒滴度为3.1×106TU/ml。用制备的病毒上清感染Lovo细胞后,荧光定量PCR和Western blot分析结果显示该慢病毒可分别在转录和蛋白质水平上抑制Lovo细胞CHD5基因的表达,并使得Lovo细胞增殖失控。结论:成功构建CHD5慢病毒表达载体,表达的慢病毒可有效的感染Lovo细胞,提高Lovo细胞的增殖能力。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的:克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法:从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果:通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论:成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

LIM结构域蛋白FHL1C抑制Notch信号途径的转录激活研究

目的：克隆人表达FHL1C基因以及建立真核表达载体和慢病毒载体。方法：从人的骨骼肌细胞来源的cDNA中扩增并克隆人FHL1C基因的编码区,连接至pMD-18T载体酶切鉴定后测序。序列测定确认后,双酶切pMD18T-FHL1C回收片段,插入真核表达载体,构建真核表达载体pCMV-Myc-FHL1C酶切鉴定正确后,转染Hela细胞及Cos7细胞,用Western Blot检测其在转染细胞中的表达,用双荧光素报告基因系统检测其对Notch信号作用。构建FHL1C-IRES-GFP表达单元,建立慢病毒表达载体plen-ti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒后感染培养的细胞,用免疫荧光显微镜、Western Blot检测分析其在被感染的细胞中的表达。结果：通过PCR方法成功扩增了人FHL1C基因的编码区。通过转染Hela及Cos7细胞,使用Western Blot检测其蛋白水平表达,双荧光报告基因系统分析均能够下调激活的Notch信号。成功构建了FHL1C慢病毒表达载体pLenti6/V5-FHL1C-IRES-GFP,包装慢病毒,把获取的慢病毒感染细胞后通过荧光显微镜证实被感染的细胞绿色荧光蛋白正确表达,Western Blot检测证实其表达。结论：成功建立起FHL1C真核表达载体及慢病毒表达系统,为研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

CEP55慢病毒表达载体构建和U251-CEP55细胞株的建立

目的:构建CEP55慢病毒表达载体,建立稳定表达CEP55的人脑胶质瘤U251细胞株。方法:使用PCR扩增方法将CEP55基因序列进行扩增,转入质粒中,并整合到载体上,构建重组质粒GV358-CEP55载体。与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞使其产生慢病毒,以GV358空载体包装的慢病毒作为对照。显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达强度,确定慢病毒的感染效率。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染人胶质瘤细胞株U251后,经嘌呤霉素筛选出稳定表达CEP55基因的细胞株U251-CEP55。q RT-PCR和Western blot两种方法分别检测CEP55 m RNA及蛋白的表达。结果:测序证实慢病毒表达载体GV358-CEP55构建成功;转染293T细胞获得高滴度的病毒。病毒感染U251细胞后,使用嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株U251-CEP55;q RT-PCR和Western blot方法分别检测后发现,U251-CEP55细胞株中CEP55 m RNA和蛋白水平的表达明显高于对照组。结论:成功构建CEP55慢病毒表达载体,获得稳定表达CEP55的人胶质瘤U251细胞株,为CEP55基因功能的探究给予了一定的实验基础。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

copGFP和PuroR双标记基因慢病毒融合表达载体的构建及应用*

目的: 构建具有绿色荧光蛋白(copGFP)和嘌呤霉素抗性基因(PuroR)融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,检测其嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性。方法: 从pCDH-CMV-MCS-copGFP载体中扩增copGFP编码区DNA序列,从pLKO.1载体中扩增Puro^R编码区DNA序列,运用重组PCR方法,扩增copGFP与Puro^R基因融合编码序列并克隆至经BamH Ⅰ+Sal Ⅰ双酶切的pCDH-CMV-MCS-copGFP载体片段中,构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;载体的融合标签序列进行测序确证;将该载体用辅助包装质粒PLP1、PLP2、VSVG在293T细胞中包装成慢病毒后感染肝癌细胞MHCC97H,检测感染细胞对嘌呤霉素的抵抗作用以及绿色荧光蛋白的表达情况;为验证该载体表达外源目的基因的有效性,将Sp1编码区DNA序列插入该载体中包装成慢病毒,用对照及表达Sp1的慢病毒感染肝癌细胞MHCC97H,感染细胞经1 mg/ml嘌呤霉素筛选7 d后获得稳定感染细胞株,提取稳定感染细胞的总RNA及总蛋白,分别运用RT-qPCR和Western blot方法检测Sp1在对照及表达Sp1的慢病毒感染的肝癌MHCC97H细胞中的mRNA和蛋白表达水平的差异。结果: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;该载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,感染细胞同时具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光蛋白特性;将Sp1编码序列插入该载体,包装慢病毒并肝癌细胞,Sp1 的mRNA水平对照细胞相比分别升高3.3倍,蛋白水平升高2.2倍(P＜0.01)。 结论: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,该载体编码的融合双标记基因具有嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性,可高水平表达长片段的目的基因。     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

Tim-3对宫颈癌细胞侵袭迁移的影响及机制研究

该文主要研究慢病毒介导的T细胞免疫球蛋白黏液素3(T-cell immunoglobulin mucin-3,Tim-3)对宫颈癌细胞的促肿瘤作用及其相关作用机制。首先,采用PCR方法获取Tim-3片段,将其克隆入pCDH载体中,并通过酶切和测序进行鉴定;将三个表达载体,即重组阳性表达载体(pCDH-Tim-3)、空载体(pCDH-NC)和绿色荧光蛋白载体(pCDH-GFP),分别与psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,最后形成相应的慢病毒组。然后,将三组慢病毒分别感染HeLa细胞,获得稳定细胞株(HeLa-Tim-3、HeLa-NC、HeLa-GFP),其中设置HeLa-NC为空载病毒阴性对照组;最后,通过观察HeLa-GFP组,初步获取慢病毒感染效率;运用流式细胞术、Western blot和细胞免疫荧光检测Tim-3的相对表达水平;细胞划痕和Transwell检测细胞的迁移及侵袭能力;Western blot检测上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail)的表达变化;流式细胞术检测细胞凋亡率变化。该文成功构建了pCDH-Tim-3慢病毒表达载体并将其包装成慢病毒,获得对应的稳定细胞株;在HeLa-GFP中可以观察到大量的绿色荧光;与HeLa-NC组相比,Western blot、流式细胞术和细胞免疫荧光检测结果均表明,HeLa-Tim-3组的Tim-3蛋白表达水平显著升高(P0.05);细胞划痕实验和Transwell检测结果均表明,HeLa-Tim-3组的迁移侵袭能力明显提高(P0.01);另外,Western blot检测结果表明,与HeLa-NC组相比,HeLa-Tim-3组N-cadherin和Snail显著增多但E-cadherin明显减少(P0.05),而流式细胞术检测结果表明,HeLa-Tim-3组凋亡率显著减少(P0.001)。因此,高表达Tim-3宫颈癌细胞可以通过EMT转化和抑制细胞凋亡等相关作用机制来加强肿瘤的恶性进展。     

GPR183慢病毒载体的构建及对Cutll1细胞凋亡的影响

该文旨在构建过表达人GPR183的慢病毒载体,研究GPR183对急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphocytic leukemia, T-ALL)细胞Cutll1凋亡的影响。通过PCR法扩增人GPR183序列片段,并连接到慢病毒表达载体质粒pEZ-Lv201上,构建过表达GPR183慢病毒质粒,包装病毒,感染T-ALL Cutll1细胞, q-PCR及Western blot检测细胞GPR183表达水平;检测GPR183对Cutll1细胞生长、周期及凋亡影响。质粒PCR及测序结果显示,成功构建GPR183过表达慢病毒载体。感染Cutll1细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光,过表达组GPR183 mRNA及蛋白表达水平较对照组明显上升(P0.01),成功构建过表达GPR183的Cutll1细胞株,过表达GPR183的Cutll1细胞生长明显受到抑制(P0.001),凋亡水平较对照组显著升高(P0.01),但不影响细胞周期。初步显示, GPR183能明显抑制T-ALL Cutll1细胞增长,促进细胞凋亡,为后续研究奠定基础。     

SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。     

TOX3基因RNAi慢病毒载体的构建及对乳腺癌ZR-75-1细胞增殖的影响

旨在构建TOX3基因RNAi慢病毒载体并观察其对人乳腺癌ZR-75-1细胞增殖能力的影响。针对TOX3基因设计干扰靶序列,构建载体,测序正确后进行慢病毒包装及滴度测定。转染ZR-75-1细胞,荧光显微镜下观察表达GFP的细胞数目,实时荧光定量PCR及Western blot实验验证转染后ZR-75-1细胞中TOX3 mRNA和蛋白的表达。MTT及平板单克隆实验检测TOX3对ZR-75-1细胞增殖能力的影响。结果显示,各组载体序列正确,病毒滴度均2×108 TU/mL,表达GFP细胞数目均可达95%以上。各干扰组TOX3 mRNA及蛋白表达水平均降低,其中TOX3-shRNA-3组干扰效果最佳,转染后ZR-75-1细胞的增殖和单克隆形成能力下降。成功构建TOX3基因的RNAi慢病毒载体,沉默TOX3后ZR-75-1细胞的增殖能力下降。     

下调人脐带间充质干细胞Mbd3基因shRNA慢病毒的构建及鉴定

研究构建靶向抑制人Mbd3表达的sh RNA慢病毒颗粒,感染人脐带间充质干细胞并用嘌呤霉素筛选获得Mbd3稳定下调的细胞系,为进一步探讨Mbd3在诱导型多潜能干细胞形成中的作用提供实验基础。研究根据Gene Bank中公布的Mbd3基因序列设计特异性si RNA干扰序列并合成可产生sh RNA的双链DNA,经双酶切后克隆至p LVsh RNA-EGFP(2A)Puro载体上构建慢病毒重组质粒,转化DH5α大肠杆菌PCR检测筛选阳性质粒,利用HEK293Ta包装产生含有Mbd3sh RNA的慢病毒颗粒。通过RT-PCR和Western blot检测慢病毒感染人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)后Mbd3的转录和蛋白表达情况,进一步检测重组慢病毒对Mbd3的沉默效果并筛选出最佳抑制效果的sh RNA慢病毒载体。结果显示成功构建并筛选出下调Mbd3的最佳慢病毒干扰载体,慢病毒感染人脐带间充质干细胞48h后于荧光显微镜下可见绿色荧光,经嘌呤霉素筛选9 d后,RT-PCR检测Mbd3表达显著降低,Western blot检测Mbd3蛋白表达明显减少。说明构建的sh RNA重组慢病毒包装成功,具有较高的感染活性,可有效抑制人脐带间充质干细胞Mbd3的表达,为后续研究脐带间充质干细胞跨胚层分化打下前期研究基础。     

慢病毒介导沉默PD-L1基因在乳腺癌细胞中的表达

构建含细胞程序性死亡因子配体1(PD-L1)基因的慢病毒载体三质粒体系,并检测其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况。p MAGic 7.1慢病毒表达载体与质粒△8.91和p VSVG用聚乙烯亚胺(PEI)共转293T包装病毒,感染并筛选获得MDA-MB-231稳转细胞系,检测PD-L1表达情况。(1)MDA-MB-231在3种乳腺癌细胞中PD-L1表达量最高;(2)三质粒转染293T细胞48 h后荧光强度增强,达到90%以上;用病毒感染MDA-MB-231细胞,48 h获得20%左右荧光强度;(3)经筛选的MDA-MB-231稳转细胞系在m RNA水平和蛋白水平低表达PD-L1,其中由p MAGic-sh1包装的病毒干扰能力最强;(4)分别加入病毒后,干扰组细胞增殖能力下降,p MAGic-sh1干扰组细胞在加入病毒7 d后生长速度约为阴性对照的64.77%;(5)混合淋巴实验显示,sh-1干扰组的肿瘤抑制率为35.8%,是正常组的3.06倍,且干扰组的T淋巴细胞活性显著增强。成功通过PEI转染试剂建立了三质粒慢病毒包装体系,该体系获得的慢病毒可有效干扰乳腺癌MDA-MB-231细胞中PD-L1的表达量,所得的干扰细胞株细胞增殖能力下降,可增强T细胞增殖活性及肿瘤细胞杀伤活性。     

Netrin-1 慢病毒表达载体的构建及延缓TGF-β 诱导HK-2 细胞上皮- 间 充质转化的初步研究*

目的:构建netrin-1基因的慢病毒表达载体,初步研究netrin-1在肾小管纤维化的作用.方法:将扩增的netrin-1表达片段克隆入FUW慢病毒表达载体,鉴定重组质粒正确性.利用HEK-293T细胞包装慢病毒,病毒感染人肾小管上皮HK-2细胞,Western blot检测重组病毒netrin-1在真核细胞内表达表达;TGF-β刺激过表达netrin-1的HK-2细胞,利用Westernblot检测其纤维化指标的变化.结果:FUW-netrin-1慢病毒表达载体测序正确,并在感染病毒的细胞中检测出特异性条带,TGF-β刺激感染netrin-1慢病毒HK-2细胞的E-cadherin的下降水平比未感染病毒组低.结论:成功构建了netrin-1的慢病毒表达载体,发现netrin-1可能延缓肾小管内皮细胞发生纤维化.     

大鼠海马神经细胞VDAC1基因shRNA慢病毒表达载体的构建及干扰效果评价

目的:构建线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC1)短发卡样RNA重组慢病毒(LV)载体,沉默海马神经细胞VDAC1基因表达,观察所构建的慢病毒载体对海马神经细胞的干扰效果。方法:根据基因库提供的大鼠VDAC1基因的核苷酸序列(序列号为：AB039662.1),设计合成3条LV3-VDAC1-shRNA及1条无义的阴性表达载体;将构建好的慢病毒载体转染到海马神经细胞,按照不同的转染条件对细胞分为空载组、对照(NC)组、病毒组,分别在病毒感染复数(MOI)值在100和10的条件下进行转染;采用荧光定量PCR和Western blot的方法分别检测VDAC1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果:与空载组相比,慢病毒感染组的扩增倍数均大于1,VDAC1基因在mRNA水平与蛋白水平表达均明显升高(P<0.05);与对照组相比,病毒感染复数(MOI)=10与MOI=100之间没有显著差异(P>0.05);PCR结果与Western blot结果综合来看,VDAC1转录水平表达越高,蛋白水平表达越低,呈现反向关联的状态。结论:三种慢病毒对海马神经细胞都有干扰效果,VDAC1基因的mR...     

PKM2在白血病NB4细胞系的分布及对c-Myc蛋白的影响

探讨PKM2在白血病NB4细胞中的分布情况及对c-Myc蛋白的影响。免疫荧光技术检测PKM2在NB4细胞中的分布情况。将含靶点序列的GV248载体、包装质粒Helper 1.0和Helper 2.0共转染293T细胞,包装慢病毒。收集病毒上清,浓缩纯化后感染NB4细胞,荧光显微镜观察感染效率,Western blotting检测PKM2和c-Myc蛋白的表达变化。CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果显示,PKM2在NB4细胞核及细胞质中均有表达,细胞核中比例较大。成功构建LV-PKM2-RNAi病毒,感染的细胞PKM2和c-Myc表达下调(p0.05),细胞增殖能力降低(p0.05)。这些结果表明PKM2主要分布在NB4细胞核,抑制PKM2表达可明显抑制NB4细胞增殖,并抑制c-Myc蛋白表达。     

Snail真核表达载体的构建及功能鉴定

目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。