筛选地中海拟无枝酸菌无痕基因敲除菌株的简便方法

将抗生素抗性基因作为标记筛选无痕基因敲除菌株比较费时,因而建立筛选无痕基因敲除菌株的简便方法。通过敲除茄红素生物合成途径中第一个反应的酶编码基因dxs(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因),获得白色地中海拟无枝酸菌突变菌株,以此菌株为受体菌,对S-丙二酰转移酶基因(mtf)进行无痕敲除。针对菌落本身携带颜色的地中海拟无枝酸菌(橘红色),利用茄红素合成酶基因dxs无痕敲除获得了白色菌株,在此基础上进行mtf的无痕敲除。以茄红素生物合成途径中任意一个反应的酶编码基因作为标记,很容易筛选得到无痕基因敲除的突变菌株。     

利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统

地中海拟无枝菌酸菌U32是力复霉素SV的工业产生菌,其遗传操作一直是一个难题。在该菌株DNA高效电转化的基础上,利用同源重组的原理,建立了地中海拟无枝菌酸菌染色体的基因置换/中断系统。通过大肠杆菌重组质粒pDK110构建、转化及两步重组筛选,成功地用α淀粉酶基因（amy）取代了地中海拟无枝菌酸菌U32染色体上的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶基因（ahbas）。第一步单交换和第二步双交换的频率分别是0.5%～0.7% 和 2%。将质粒pDK110变性后转化可显著提高重组频率,在第二步筛选双交换前对单交换重组子进行电击也能够提高其双交换重组的频率。此外,通过转化构建的两端带同源区段的线性DNA片段及一步重组筛选,我们在地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的amrD,rifO基因中间插入了阿普拉霉素抗性基因（apr）,其效率约为30～50转化子/μgDNA。     

地中海拟无枝酸菌“硝酸盐效应”的研究进展

地中海拟无枝酸菌"硝酸盐效应"是指发酵基质中的硝酸盐在一定浓度下大幅度促进该菌合成利福霉素,并对初级代谢产生多种影响的现象。针对该效应,本实验室开展了多年的研究,阐明硝酸盐主要通过两个方面促进利福霉素的生物合成:一方面,硝酸盐增加利福霉素生物合成前体的供给(如UDP-葡萄糖、AHBA、丙二酰Co A以及甲基丙二酰Co A等),尤其是通过抑制体内脂肪酸的合成来保障利福霉素前体丙二酰Co A的供给;另一方面,硝酸盐提升利福霉素生物合成酶基因的表达。因此,在充足的利福霉素前体和合成酶系的协同效应下,菌体生成大量的利福霉素。进一步的工作将围绕"硝酸盐效应"的信号分子、信号转导途径以及相关基因的表达调控和翻译后修饰机制等方面展开。     

等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株

利福霉素SV毒性低、疗效高、抗菌谱广,主要由地中海拟无枝酸菌发酵生产,其发酵过程属于耗氧发酵,供氧直接影响产物形成.为减少发酵过程氧限制影响,进一步提高利福霉素发酵产量,通过构建定向氧限制模型,将常温常压等离子体诱变和无水亚硫酸钠氧限制筛选模型相结合,建立了利福霉素生产菌株24孔板快速培养的高通量筛选方法,高效选育出能...     

地中海拟无枝菌酸菌U32染色体特性的脉冲场电泳分析

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32是产力复霉素SV的工业生产菌株。采用脉冲场电泳分析发现,地中海拟无枝菌酸菌U32仅有一条约10 Mb的线性染色体, 没有内源性质粒。利用Southern杂交法,对11个编码力复霉素生物合成、相关初级、次级代谢关键酶以及调控蛋白的基因,在U32染色体DNA的PshBI酶切片段上进行了定位。分析发现在一条长度约700kb的PshBI酶切片段上,分别存在着力复霉素合成基因簇(rif)、氮代谢的亚硝酸还原酶小亚基基因(nasD)、衔接初级与次级代谢的甲基丙二酰变位酶基因(mcm)、脂肪酸代谢的乙酰辅酶A羧化酶生物素载体蛋白基因(accA)以及一套核糖体RNA转录单元。同时还发现U32至少有5套核糖体RNA转录单元。其余定位的基因均只出现单一杂交信号。     

国家自然科学基金委员会生命科学部2008年度资助重点科学基金项目一览表

项目名称项目负责人依托单位长残留除草剂污染土壤微生物修复的分子生物学机理及其应用研究李顺鹏南京农业大学产利福霉素SV地中海拟无枝菌酸菌U32氮同化代谢调控网络及信号赵国屏中国科学院上海生命科学研究院转导机理之解析模拟人体内环境研究白念珠菌形态转变的分子机制陈江     

Sterptomyces rochei4089的L基因阻断变株的构建及功能研究

运用同源重组技术破坏了一株格尔德霉素产生菌Sterptomyces rochei 4089的L基因,该基因编码氧化还原酶.以Sterptomyces rochei 4089基因组总DNA为模板,PCR扩增AHBA-KLM基因簇,采取Red/ET重组技术,构建L基因阻断质粒pKC1139-KLM-KmR.采用大肠杆菌与链霉菌的结合转移将阻断质粒含AHBA-KLM基因簇和Kan表达单元的3.0 kb线性片段转化Sterptomyces rochei 4089菌株,在卡纳霉素的平板上筛选卡纳霉素抗性转化子,经PCR检测分离到L基因阻断突变菌株.对原、变株的发酵液进行TLC和HPLC分析显示,Sterptomyces rochei 4089基因组中的L基因失活后,导致该菌株不能合成安莎类抗生素格尔德霉素.通过阻断L基因,为筛查这类放线菌产生安莎类抗生素提供了明确的组分指示作用.     

无机磷对力复霉素合成的调节

本文报道无机磷抑制力复霉素产生菌地中海诺卡氏菌U-32中力复霉素(SV)的合成。随着丰富培养基中无机磷浓度的增加,SV的合成受到明显抑制,最高抑制率达sO％,而阔体生长则增加65％。不同时间加入无机磷对抗生素产量的影响是不相同的,在抗生素合成前(O一48h),无机磷的加入能严重影响SV的合成,但在合成期(72 h以后)加入则几乎不影响SV的产量。提高培养基中无机磷的起始浓度,使菌体合成脂肪量增加70％：甲基丙二酰CoA羧基转移酶和甲基丙二酰CoA羧基变位酶的活力受到明显抑制：菌体内腺苷化台物ADP、ATP的含量在整个发酵期都明显增加,细晦内能荷水平也因培养基中无机磷的起始浓度增加而提 高。     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现：通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。     

弗氏2a志贺菌htrA基因突变体的构建

目的:构建弗氏2a志贺菌2457T的htrA基因缺失突变株及HtrA酶失活突变株,以便进一步研究HtrA蛋白的功能。方法:用PCR扩增htrA基因上下游同源臂,构建含有kan基因的打靶片段,采用λ-Red重组系统对htrA基因进行缺失,用PCR进行验证;通过定点突变的方法构建HtrA酶失活突变株,并测序验证。结果与结论:构建了2457T htrA缺失突变株和2457T/htrAFSA酶失活突变株。     

胸腺素α1的乙酰化修饰不依赖于乙酰转移酶RimL

目的：考察大肠杆菌乙酰转移酶RimL对胸腺素α1（Tα1）乙酰化修饰的影响。方法：构建含500bp同源臂的卡那抗性基因打靶片段,利用Red同源重组系统,使大肠杆菌B121（DE3）的rimL基因插入失活,随后导入质粒pCP20去除抗性基因,构建突变菌株rimL-BL21（DE3）;将重组质粒pET-Tα1-L12分别转入出发菌株和突变菌株中进行表达,经固定金属离子亲和层析和反向高效液相层析后,将所得纯品进行质谱分析,精确测定相对分子质量。结果：PCR鉴定结果证明成功敲除rimL基因;质谱结果表明,rimL基因敲除菌中所表达的Tα1-L12融合蛋白与出发菌株一样,均有部分乙酰化修饰。结论：Tα1的乙酰化修饰并不依赖于RimL。     

力复霉素前体甲基丙二酰CoA合成途径的研究

力复霉素合成的碳前体之一(2R)—甲基丙二酰CoA至少可以有三条酶学合成途径。三条途径中的关键酶分别为甲基丙二酰CoA转羧基酶、丙二酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA消旋酶。通过比较各个酶活性的时间进程和力复霉素合成时间的相关性,以及各个酶的底物亲合力,对它们在地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)甲基丙二酰CoA合成中的贡献作了排序,发现甲基丙二酰CoA变位酶途径是主要负责酶系。但是各个途径的贡献排序并不是固定不变的,能受到环境因素的调控,丙酸盐的加入将抑制甲基丙二酰CoA变位酶活力,而使得甲基丙二酰CoA转羧基酶成为主要酶系。甲基丙二酰CoA合成途径的多样性有助于细胞对环境变化的灵活反应。此外,对各个酶的调控特性也进行了研究。     

地中海拟无枝菌酸菌U—32的3—氨基5—羟基苯甲酸合成酶（AHBAS）？…

地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２是一种临床上重要的抗生素－力复霉素ＳＶ的产生菌,研究表明,在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中,３－氨基５－羟基苯甲酸合成酶（ＡＨＢＡＳ）是合成中间体Ｃ７Ｎ母核（又称ＡＨＢＡ）的关键酶。通过筛以广宿主粘粒ｐＬＡＦＲ３为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的基因文库,获得６个阳性克隆子。将含有ＡＨＢＡＳ基因的约２．５ｋｂ的片段克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ和ＫＳ     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位（由丙二酰CoA提供）和丙酸单位（由甲基丙二酰CoA提供）为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3％,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21％以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响*

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位(由丙二酰CoA提供)和丙酸单位(由甲基丙二酰CoA提供)为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3%,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21%以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建

目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活,再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。PCR鉴定发生插入突变的菌株,应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖,考查对重组蛋白表达的影响。结果:PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较,突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化,但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。结论:大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株可以用于重组蛋白的表达。     

地中海拟无枝菌酸菌U-32对硝酸盐的同化及其硝酸还原酶特性

对地中海拟无枝菌酸菌U-32菌株的研究发现,像植物及真菌硝酸还原酶一样,地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶也是诱导酶,其合成受铵盐阻遏,受硝酸盐的诱导。氯霉素抑制实验的结果表明,该菌株硝酸还原酶的诱导涉及到蛋白质的新合成。钼和钨的竞争实验说明U-32菌株硝酸还原酶也为一钼酶。另外在离体实验中,发现硝酸还原酶活力受到KCN和NADH的抑制,但至今未能找到其生理电子供体。此外,U-32菌株硝酸还原酶也不表现类似于植物的黄递酶等组份酶活性。该菌株硝酸还原酶和其力复霉素产量有一定相关性,但两者确切的关系尚待研究。     

地中海拟无枝菌酸菌U-32对硝酸盐的同化及其硝酸还原酶特性

对地中海拟无枝菌酸菌U-32菌株的研究发现,像植物及真菌硝酸还原酶一样,地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶也是诱导酶,其合成受铵盐阻遏,受硝酸盐的诱导。氯霉素抑制实验的结果表明,该菌株硝酸还原酶的诱导涉及到蛋白质的新合成。钼和钨的竞争实验说明U-32菌株硝酸还原酶也为一钼酶。另外在离体实验中,发现硝酸还原酶活力受到KCN和NADH的抑制,但至今未能找到其生理电子供体。此外,U-32菌株硝酸还原酶也不表现类似于植物的黄递酶等组份酶活性。该菌株硝酸还原酶和其力复霉素产量有一定相关性,但两者确切的关系尚待研究。