酿酒酵母中a-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson’s Disease, PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一。研究显示, a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用。以酿酒酵母为模式系统, 通过调控a-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响a-synuclein聚集状态的因素, 对a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究。结果表明, a-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性, 而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关; 超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解a-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制。上述结果表明, 蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在a-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用。     

酿酒酵母中a-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson’s Disease, PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一。研究显示, a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用。以酿酒酵母为模式系统, 通过调控a-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响a-synuclein聚集状态的因素, 对a-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究。结果表明, a-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性, 而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关; 超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解a-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制。上述结果表明, 蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在a-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用。     

酿酒酵母中α-synuclein蛋白聚集诱导的细胞毒性的研究

帕金森症(Parkinson's Disease,PD)是当今最为广泛的神经退行性疾病之一.研究显示,α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中有着非常重要的作用.以酿酒酵母为模式系统,通过调控α-synuclein蛋白在胞内的表达量或改变其它一些可能影响α-synuclein聚集状态的因素,对α-synuclein蛋白在帕金森症的发生过程中可能的细胞毒性机制进行了研究.结果表明,α-synuclein蛋白的高水平表达会明显增强该蛋白因聚集所诱导的细胞毒性,而且这种细胞毒性与细胞代谢状态明显相关;超表达酿酒酵母分子伴侣YDR533C可以明显缓解α-synuclein蛋白异源表达对酵母生长的抑制.上述结果表明,蛋白折叠与折叠过程中的质量控制在α-synuclein蛋白聚集过程中有着非常重要的作用.     

脯氨酰顺—反异构酶的纯化及对重组蛋白质折叠反应…

脯氨酰异构是蛋白质折叠反应的限速步骤之一,体内被脯氨酰顺－反异构酶（ＰＰＩ）所催化。为了研究ＰＰＩ在重组蛋白体外折叠复性中的作用,我们自猪肾脏中纯化了ＰＰＩ,并对重组蛋白的酶促折叠过程进行了探讨。结果表明,ＰＰＩ催化的重组蛋白的折叠率和比活性,ＰＰＩ催化的重组蛋白的折叠反应主要是提高了它们了折叠速率,而不增加正确折叠率的比活性。ＰＰＩ在很低的浓度下即有很高的催化活性。     

脯氨酰顺－反异构酶的纯化及对重组蛋白质折叠反应的催化性能

脯氨酰异构是蛋白质折叠反应的限速步骤之一,体内被脯氨酰顺－反异构酶(PPI)所催化．为了研究PPI在重组蛋白体外折叠复性中的作用,我们自猪肾脏中纯化了PPI,并对重组蛋白的酶促折叠过程进行了探讨．结果表明,PPI催化的重组蛋白的折叠反应主要是提高了它们的折叠速率,而不增加正确折叠率和比活性,PPI在很低的浓度下即有很高的催化活性．     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A,DsbA）是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys³⁰残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys³⁰残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

蛋白错折叠及其纠正机制

尽管目前已知由各种力之间的复杂平衡维持着蛋白质三维结构 ,但对体内蛋白折叠的机理仍知之甚少。大量研究表明 ,蛋白体外折叠常受竞争过程制约[1,2 ],在非平衡生理条件下 ,错折叠可由暴露在折叠中间物中的疏水表面交联而发生[3]。蛋白错折叠时形成的错误构造影响蛋白结构正常形成 ,可导致人老年斑和神经纤维原混乱增加 ,进而诱发出现典型的老年性痴呆。Ｊｅｎ等[4 ]研究发现神经多肽中的淀粉多肽 (Ａβ)错折叠对体内神经细胞具有毒性作用 ,氧化胁迫和Ｃａ积蓄不稳定可诱导编码淀粉前体蛋白 (ＡＰＰ)及老年痴呆症相关的基因发生突变 ,使长度…     

嗜温冷休克蛋白力致去折叠研究

嗜温冷休克蛋白拥有一个由五个β股形成的反平行β桶结构,目前已被用于蛋白质去折叠的研究。当使用机械力对嗜温冷休克蛋白进行拉伸研究时,发现嗜温冷休克蛋白的去折叠过程具有明显的中间态。在常速和常力两种情况下对嗜温冷休克蛋白进行拉伸分子动力学模拟,发现其在两种情况下具有相同的去折叠次序,即C端β片层首先去折叠,随后N端β片层去折叠;同时这两种模拟都表现出明确的中间态。研究结果表明,嗜温冷休克蛋白抵抗外力作用除了依赖链间氢键外,分子内的静电相互作用也发挥着重要的作用。     

内质网应激与心血管疾病

内质网存在于除哺乳动物成熟的红细胞外的各种真核细胞中,是蛋白质合成折叠、Ca2+储存和脂质合成的重要场所。多种因素刺激引起的内质网内稳态的失衡会导致未折叠蛋白、错误折叠蛋白堆积,即内质网应激。通过激活未折叠蛋白反应,细胞发生适应或凋亡。内质网应激参与了多种心血管疾病的病理过程,是研究心血管疾病发病机制和治疗干预的新途径。     

未折叠蛋白反应在神经退行性疾病中的作用

作为蛋白质分泌途径中蛋白质稳态的主要调节者,未折叠蛋白反应在正常和疾病中都起着至关重要的作用。本文简述了未折叠蛋白反应是否参与神经退行性疾病的发生发展。在许多体外和体内神经退行性病变模型中,未折叠蛋白反应的调节已显示出明显的应用前景。随着未折叠蛋白反应的研究不断深入,还出现了众多靶向未折叠蛋白反应的治疗策略。     

生命,死亡,未折叠蛋白反应与细胞凋亡

发生在细胞内的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是对内质网中未折叠蛋白聚积的应答。轻度内质网应激引起未折叠蛋白反应,出现新蛋白合成的暂停,使内质网有时间合成更多的分子伴侣来折叠蛋白质,从而使其功能恢复正常;严重或持续的内质网应激反应将导致细胞凋亡。     

未折叠蛋白反应的信号转导

在内质网中,分泌性蛋白、跨膜蛋白和内质网驻留蛋白折叠成天然构象,经过修饰后,形成有活性的功能性蛋白质。如果蛋白质在内质网内的折叠受到抑制,造成未折叠蛋白聚集,将引起内质网应激。激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,使蛋白质的生物合成减少,内质网的降解功能增强,从而降低内质网负担,维持细胞内的稳态。如果内质网应激持续存在,则可能诱发细胞凋亡。研究表明,未折叠蛋白反应能在多种肿瘤细胞中发生,并能促进肿瘤细胞的生长。本文对未折叠蛋白反应与肿瘤研究的最新进展进行综述。     

动力学接触序: 基于量子跃迁的蛋白质折叠速率参数

把蛋白质折叠看成多肽链上扭转态间的量子跃迁, 依据构象动力学的量子理论, 提出用接触残基间多肽链转动惯量和扭转势能来表征接触特性的动力学接触序, 从而能定量地从动力学角度研究蛋白质折叠速率. 在80个蛋白的数据集上实验, 证实了构象量子跃迁观点的合理性并得到以下结论: (1) 折叠速率与接触转动惯量之间存在显著相关性; (2) 多态蛋白的折叠可以看成在同样转动惯量、温度等条件下的二态蛋白折叠基础上的中间态延迟, 并估计了延迟时间的数量级; (3) 折叠可以分为释能和吸能两类, 蛋白质折叠速率上限由释能折叠决定, 并导出大多数折叠速率大的二态蛋白的量子跃迁过程为释能反应, 而折叠速率小的多态蛋白为吸能反应.     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A(DisulfidebondformationproteinA,DsbA)是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys30残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys30残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

人重组IL6／IL2融合蛋白的变性、复性及纯化

经超声破碎,分离已表达CH925包涵体,较系统地研究变性剂浓度、融合蛋白浓度对蛋白折叠的影响.在还原型及氧化型谷胱甘肽复性条件下,成功地将融合蛋白CH925折叠成具有IL6及IL2双活性蛋白,IL6的比活为2.3×10⁸U/mg, IL2比活为2.2×10⁶U/mg.经阴离子交换、凝胶过滤层析,获得一定纯度的CH925,配合反相HPLC.洗脱收集蛋白峰,CH925纯度为98%.     

内质网应激诱导自噬的分子机制

在真核细胞中,内质网对蛋白质的折叠和运输至关重要,多种病理因素对内质网稳态的扰乱,可导致内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白蓄积,即内质网应激(ERS)。细胞为此通过激活一种叫做未折叠蛋白反应(UPR)的防御反应来恢复内质网稳态。自噬是一种被描述为"自我吞食"的细胞代谢过程,其通过批量清除和降解未折叠蛋白以及破损细胞器在ERS时作为一种重要的保护机制。近年的研究显示这两个系统动态互联,且ERS可以通过多种方式诱导自噬的发生。在本文中,我们将总结目前关于ERS尤其是UPR诱导自噬的分子机制的相关知识,以进一步指导关于ERS与自噬关系的的研究。     

重组白细胞介素2体外折叠的实验研究

包涵体中的重组蛋白抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的体外折叠（即复性）是基因工程下游处埋中的重要环节。荧光光谱研究表明,ＩＬ－２分子折叠过程中荧光强度逐渐减小,最大发射峰由３１６ｎｍ红移到３４８ｎｍ。以Ｔｒｐ残基的暴露程度反映分子的折叠状态。ＧＭ－ＣＳＦ在折叠过程中的荧光强度有类似变化;凝胶排阻ＨＰＬＣ可以检测折叠过程中的聚合体;而反相ＨＰＬＣ可以将ＩＬ－２分成三个相互独立的异构体色谱峰。据此可以计算出ＩＬ－２分子的正确折叠率。常用的稀释复性方法,随着ＩＬ－２浓度的增高,它的正确折叠率逐渐降低,蛋白浓度的对数与正确折叠率之间大致呈线性关系。当ＩＬ－２浓度为１ｍｇ／ｍＬ时,其正确折叠率仅为３０％,而采取较低的蛋白浓度进行复性会因大量的样品体积导致后期纯化的困难。     

分子伴侣 SecB 基因和人淋巴毒素基因在大肠杆菌中的共表达

分于伴侣(Chaperohe)是细胞内催化及维持其他蛋白质正确梅象的一类蛋白质分子^[1,2]。研究表明,分子伴侣参与细胞内许多蛋白质的折叠、聚合以及跨膜运输^[3,4],通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中间体,阻止了蛋白中间体的聚集,帮助其形成正确构象^[5,6]。SecB是一个胞质酸性蛋白．单体分子量为17kDa,在体内以4～6个相同亚基组成的寡聚体形式存在。它在大肠杆菌中参与蛋白质分泌系统,纯化后进行离体试验表明,它可以阻止抗蛋白酶的pre-MBP的出现,能稳定地结合前体蛋白．使其处于适合运输的构型^[7],它的作用是使蛋白质可以在正确折叠前跨过细胞膜,运输到细胞周质中。SecB通过与前体蛋白结合．从而阻止前体蛋自由于不正确折叠发生的聚集,属于分子伴侣家族的成员。分子伴侣的这些特性使得它们在基因工程中具有广阔的应用前景。外源蛋白在大肠杆菌中高表达时往往形成无活性的包涵体,包涵体大多是蛋白质在过量表达过程中不正确折叠形成的^[8],正确构象的形成需要在体外进行变性和复性。蛋白质的复性过程十分复杂,在方法上缺少一定的规律可循,特别是分子量较大以及二硫键较多的分子,复性更加困难,有的甚至根本难以复性。分子伴侣可以促进其它蛋白质的正确折叠,设想在基因工程中如果将分子伴侣基因与外源蛋白基因共存表达,可能会有效地促进外源蛋白形成正确的构象．提高其活性,减少包涵体的形成,对基因工程下游的处理带来很大方便。根 据这个思路,我们将克隆的SecB基因与重组人淋巴毒索(Lymphotoxin,简称LT)基因在同一个大肠杆菌细胞中共存表达,来研究分子伴侣SecB对外源基因表达的影响。     

AUT凝胶电泳在牛胰核糖核酸酶折叠研究中的应用

目的:牛胰核糖核酸酶是一种用于蛋白折叠研究的经典模式蛋白,在折叠研究过程中主要使用高效液相色谱用于分离检测不同阶段的蛋白折叠中间体。高效液相色谱具有自动化、分离效果好、样品可回收等优点,同时也存在检测通量较低、仪器设备较为昂贵等不足。AUT凝胶电泳简便、快捷、检测通量较高,本文尝试将其应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。方法:使用AUT凝胶电泳、酶活性检测、质谱对牛胰核糖核酸酶还原变性过程及产生的折叠中间体进行检测;通过高效液相色谱和质谱对折叠中间单体进行分离检测,并分别进行AUT凝胶电泳检测以解析各折叠中间单体在电泳中的条带位置;通过AUT凝胶电泳和酶切后质谱鉴定各折叠中间单体的二硫键配对方式。结果:AUT凝胶电泳可以有效区分不同条件下的牛胰核糖核酸酶还原变性过程,检测结果与酶活性、质谱结果相符,并可以很好地区分牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体。高效液相色谱将牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体分离为13个色谱峰,并与AUT凝胶电泳中的11个条带位置进行匹配。确认牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间单体的二硫键配对方式,并与AUT凝胶电泳条带进行匹配,Cys58-Cys110和Cys26-Cys84构象熵减作用强于Cys40-Cys95和Cys65-Cys72。结论:AUT凝胶电泳适用于检测牛胰核糖核酸酶折叠中间体,可以与高效液相色谱、质谱等检测技术相互补充,共同应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。     

疱疹病毒与内质网应激

内质网是分泌型蛋白和膜蛋白折叠及翻译后修饰的主要场所.病毒感染所引起的宿主细胞内环境的改变可使细胞或病毒的未折叠和/或错误折叠蛋白在内质网中大量聚集,使内质网处于生理功能紊乱的应激状态.为了缓解这种应激压力,细胞会启动未折叠蛋白反应(UPR),并通过一系列分子的信号转导维持内质网稳态;同时病毒也会通过对UPR的精密调控...