Bacillaene酮还原酶结构域的异源表达及底物特异性分析

Bacillaene生物合成过程中,聚酮合酶第一个延伸模块的酮还原酶结构域(Bac KR1)既催化α酮基的还原,也催化β酮基的还原,具有天然的底物宽泛性。为进一步研究该结构域的底物特异性,在大肠杆菌中对其进行了异源表达。体外酶学分析表明Bac KR1可以催化聚酮类底物(±)-2-甲基-3-氧代戊酸-乙酰半胱胺硫酯外消旋体的立体选择性还原,仅生成4种非对映异构体中的一种,此外Bac KR1还可以催化环己酮和对氯苯乙酮等非聚酮类底物的还原,暗示了聚酮合酶中酮还原酶结构域作为生物催化剂的潜力。     

定点突变改变近平滑假丝酵母SCRⅡ催化苯乙酮衍生物底物谱

【目的】通过定点突变技术,改变近平滑假丝酵母短链羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)催化苯乙酮衍生物的功能,为数种手性芳香醇的生产提供一种高效、安全的新型制备方法。【方法】通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法,选择SCRⅡ的底物结合域中关键氨基酸位点E228实施突变,构建相应的突变株Escherichia coliBL21/pET28a-E228S;以苯乙酮衍生物为底物,对突变株的酶活和生物转化功能进行了分析。【结果】酶活测定结果表明:突变株E.coli BL21/pET28a-E228S催化原始底物2-羟基苯乙酮的酶活仅为原始酶活的25%左右;而催化苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮的酶活是突变前的7-20倍。突变株E.coli BL21/pET28a-E228S生物转化2-羟基苯乙酮,获得产物(S)-苯基乙二醇的得率不超过10%,而以苯乙酮、4’-甲基苯乙酮、4’-氯苯乙酮为底物时,生物转化产物光学纯度维持在99%,得率高达80%以上。【结论】对底物结合域中的关键氨基酸实施突变,提高了SCRⅡ催化苯乙酮衍生物的底物广谱性,拓展了该酶的生物功能,为理性改造短链羰基还原酶的不对称还原催化功能和手性芳香醇的制备提供了新型途径。     

吡咯喹啉醌产生菌筛选方法建立及菌种筛选

吡咯喹啉醌(PQQ)是一种氧化还原酶的辅酶,具有多种生理功能。扩增得到大肠杆菌葡萄糖脱氢酶(GDH)基因,并利用表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中进行了表达。纯化了可溶性表达产物,并建立了基于GDH的重组酶法分析PQQ的方法。确定了甲基营养菌筛选模型,从2000余份土样中分离得到一株PQQ高产生菌MP606,在未经培养条件优化及诱变选育的条件下PQQ产量达113mg/L。从该菌培养液中制备得到了产物的结晶,HPLC分析、特征光谱分析以及酶法分析均证实该产物为PQQ。扩增并分析了MP606的16S rDNA序列,结果显示该菌16S rDNA序列与12种甲基营养菌都具有95%以上同源性,其中与食甲基菌属两菌株的16S rDNA序列同源性达99%。     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶基因的克隆、表达及酶活性研究

旨为研究嗜酸喜温硫杆菌硫加氧还原酶的生化特性,以嗜酸喜温硫杆菌TST3的基因组DNA为模板,PCR扩增出硫加氧还原酶基因(sor),构建了表达载体p ET-sor,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(p ET-sor2)。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导,该重组菌可以表达目的蛋白SOR。对诱导条件进行优化,并在最优的条件下诱导SOR酶表达,再经超声波破碎重组菌,上清液通过Ni+-NTA亲和层析柱纯化获得重组酶,其催化氧化反应的比酶活、Km值和Vmax分别为0.70U/mg,15.672×10-2 g/m L和12.755×10-5 mol/(L·min),而催化的还原反应的比酶活、Km值和Vmax分别为2.21 U/mg,0.507×10-2g/m L和4.876×10-5 mol/(L·min)。     

高选择性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化

【目的】通过表达多种重组立体选择性氧化还原酶,分析其催化不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)的性质,从而构建酶促合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)的反应体系。【方法】基于已有立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。【结果】筛选获得产物构型为(S)-型的催化活性最高的酶为CR2,该酶米氏常数Km为0.135 mmol/L,kcat/Km为3.689 L/(mmol·s),最适p H 8.4(0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液),最适反应温度为35°C,在10-45°C条件下和p H 7.5-8.5较为稳定,Zn2+离子对酶活有促进作用。CR2催化DKTP不对称还原反应6 h后,DHTP的产率达92.1%、光学纯度达99.9%。【结论】基于活性和选择性分析,获得不对称还原DKTP的目标酶CR2,其催化特性有利于高立体选择性还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,从而为进一步提高酶促不对称还原DKTP的转化效率提供研究基础。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

产(R)-1,3-丁二醇的工程菌构建及转化条件研究

[目的]利用重组大肠杆菌实现(R)-1,3-丁二醇的生物合成。[方法]从脱硫球菌(Desulfococcus biacutus)中克隆得到羰基还原酶基因DbCR,构建pET28a-DbCR表达载体并在大肠杆菌E.coli BL21中表达,利用气相色谱对反应液进行检测。[结果]DbCR在pH 7.5、35℃的最适条件下的酶活力为4.5 U/mL。在50 mL全细胞反应体系中,重组工程菌在pH 7.5、30℃条件下,反应48 h时,对300 mmol/L底物4-羟基-2-丁酮的转化率 96%,产物(R)-1,3-丁二醇的e.e.值 99%。[结论]构建得到高效催化合成(R)-1,3-丁二醇的工程菌,工程菌对底物的转化率96%,产物纯度 99%。     

白地霉的戊糖代谢——Ⅰ.木糖代谢的初步变化途径

(1)用在木糖上培养的白地霉2.361无細胞提取液进行了木糖代謝酶体系的研究。查明木糖代謝的初步变化途径如下: D-木糖 TPNH H~ →木糖还原酶←木糖醇 TPN~ (1) 木糖醇 DPN~ →木糖醇脫氫酶←D-木酮糖 DPNH H~ (2) D-木酮糖 ATP→D-木酮糖激酶D-木酮糖-5-磷酸(3) (2)催化式(1)的酶为木糖还原酶,需要TPN。用紙层析法鉴定木糖还原的产物为木糖醇。(3)催化式(2)的酶称木糖醇脫氫酶,需DPN。(4)催化式(3)的酶为D-木酮糖激酶,所試过的其他戊糖在同样条件下均不被磷酸化。(5)白地霉无細胞提取液中测不出木糖(?)构酶的活力。排除了这一途径的可能性。(6)催化式(1)(2)(3)各反应的酶均有适应形成的特性,符合Stanier的連續适应学說。     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

dhaBCE基因与yqhD基因串联表达载体的构建及其生物转化甘油

将来自于肺炎克雷伯氏杆菌的甘油脱水酶基因插入到质粒pET28(a+) -yqhD的上游,并用SD序列隔开,串联构建重组质粒pET28(a+)dhaBCE-yqhD,转化到大肠杆菌E.coli novablue中进行共表达。结果显示：含有pET28(a+) dhaBCE-yqhD的重组菌在28℃条件下,IPTG诱导16h后,甘油脱水酶和yqhD氧化还原酶的酶活力分别达到35 U/ mg和 82 U/ mg ,而对照组检测不到甘油脱水酶酶活;当甘油浓度为55g/L,产物1,3-PD的产量可达39g/L;甘油浓度过量不利于产物合成,且产物1,3-丙二醇对合成反应具有一定的抑制作用。     

融合酶CR2-GDH合成度洛西汀前体的体系与过程调控

以具有高选择性的羰基还原酶(CR2)与可实现辅酶原位循环的葡萄糖脱氢酶(GDH)通过柔性连接肽得到的融合酶CR2-GDH为生物催化剂,催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)不对称还原合成手性药物度洛西汀重要中间体(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺((S)-DHTP)...     

酮古龙酸菌与呼吸链偶联的2-KGA代谢途径研究进展

酮古龙酸菌可将底物L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。该菌共存在5种反应参与2-KGA代谢,包括:1D-山梨醇氧化为L-山梨糖;2L-山梨糖氧化为L-山梨酮;3L-山梨酮(吡喃型)氧化为2-KGA;4L-山梨酮(呋喃型)氧化为维生素C。52-KGA还原为L-艾杜糖酸。其中L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶(SSDH)参与反应123,L-山梨糖脱氢酶(SDH)参与反应23,L-山梨酮脱氢酶(SNDH)参与反应34,醛脱氢酶(ALDH)参与反应3,2-KGA还原酶(2-KGR)参与反应5。SDH/SSDH/ALDH属于Ⅰ型醌酶,其辅酶为1分子PQQ;SNDH属Ⅱ型醌酶,与PQQ、heme C共同构成quinohemoproteins,2种醌酶均分布于周质空间中与呼吸链相偶联,意味着这种膜上直接氧化过程伴随ATP产生,使得菌体可以利用环境中的底物实现快速供能。     

一种来源于毕赤酵母的高对映选择性羰基还原酶的性质及底物谱分析

手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇.从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母 P.pastoris GS115中的羰基还原酶.根据其核酸序列设计引物,从P.pastoris GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21 (DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究.PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性.对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1. PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97％以上.因此,PPCR具有较好的应用前景.     

近平滑假丝酵母(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中的外泌表达及高效转化(R)-苯基乙二醇

克隆了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(R)-羰基还原酶基因rcr,构建胞外表达工程茵Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b-rcr,实现了(R)-羰基还原酶在大肠杆菌中高效外泌表达,周质空间和发酵液酶的比活力分别达0.68 U/mg和0.26 U/mg,与大肠杆菌的胞内体系重组酶相比,酶的比活力提高了近两倍。为了更好地促进该重组酶的外分泌于大肠杆菌细胞外,通过添加温和型化学渗透剂甘氨酸,改善细胞壁的透性,(R)-羰基还原酶的活力提高至1.99 U,与添加甘氨酸前相比,酶活力提高了12.4倍,比活提高了4.3倍。浓缩后的发酵液催化2-羟基苯乙酮,产生(R)-苯基乙二醇,产率为88.1%,e.e.值为93.9%。与胞内重组酶相比,产率和光学纯度分别提高了44.4%和15.9%。本研究通过构建(R)-羰基还原酶的大肠杆菌分泌表达体系,大幅度提高了(R)-羰基还原酶的比活和生物转化手性醇的效率。     

(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇北大核心CSCD

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

普通生酮基古龙酸菌中山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶的纯化及酶学性质分析

【目的】对源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare WSH-001)的山梨糖脱氢酶(Sorbose dehydrogenase,SDH)和山梨酮脱氢酶(Sorbosone dehydrogenase,SNDH)的酶学性质进行分析。【方法】以K.vulgare WSH-001基因组DNA为模板,PCR扩增得到山梨糖脱氢酶基因(sdh)和山梨酮脱氢酶基因(sndh),构建重组表达质粒p ET28a-sdh、p ET28a-sndh,并分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中。利用镍柱亲和层析和凝胶过滤层析得到纯化的SDH和SNDH。【结果】成功构建产SDH和SNDH的大肠杆菌BL21(DE3)并对目的酶进行纯化。SDS-PAGE分析结果表明,SDH和SNDH的大小分别为64 k Da和48 k Da,与理论预测值一致。显色法测得SDH酶活为3.15 U/mg,最适反应温度为30°C,最适反应pH为8.0左右;SNDH酶活为6.12 U/mg,最适反应温度为35°C,最适反应pH为8.0左右。在pH 3.0、4.0、5.0的偏酸性条件下,2个酶的酶活受到显著影响。【结论】表达并纯化了来源于普通生酮基古龙酸菌来源的SDH、SNDH,并进行了酶学性质分析,为利用SDH、SNDH实现维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的一步法发酵生产提供了必要的参考。     

南沙链霉菌来源细胞色素P450酶CYP154C34的表征及生物转化

【目的】P450酶作为一种多功能生物催化剂,可在温和条件下高区域和立体选择性地催化复杂化合物中未活化的C-H键,因此P450酶在化工原料合成、环境污染物降解及药物合成等领域都具有重要作用。本文对南沙链霉菌基因组中的一个新颖的P450酶CYP154C34进行研究,通过构建异源表达和全细胞生物转化重组菌探究其功能。【方法】构建2种全细胞生物转化BL21(DE3)重组菌(含p ET28a-CYP154C34-RhFRED和pET28a-CYP154C34+pACYCDuet-Pdx/PdR)和1种异源表达BL21(DE3)重组菌(含pET28a-CYP154C34)。通过全细胞生物转化的方式筛选底物,分析催化功能及产物结构。比较2种全细胞生物转化重组菌和体外酶反应对底物的转化率。分析CYP154C34和不同底物及底物类似物的亲和力。【结果】通过底物筛选和产物鉴定发现CYP154C34可催化包括孕酮、睾酮、雄烯二酮在内的9种甾体化合物16α位羟基化。通过2种不同还原伴侣的全细胞体系及体外酶反应对底物转化率的比较,发现含有pET28a-CYP154C34-RhFRED的BL21(DE3)重组菌的...