小鼠海马神经元冰冻切片和脑片培养方法的比较

目的:通过冰冻切片和脑片培养方式比较获得更适合脑片实验研究的方法。方法:分别运用急性切片和脑片培养方法,结合全细胞膜片钳技术比较两种脑片处理方法对小鼠海马神经元细胞形态、细胞膜封接难易程度、细胞电生理特性等的差异,获得更适合细胞研究的脑片获取方法。结果:冰冻切片方法切断部分神经纤维,脑片表层出现肿胀或坏死细胞,2-3层细胞可用于膜片钳记录,但不易封接破膜。脑片培养后可使纤维再生,整个脑片细胞形态清晰可见,容易封接破膜,电生理记录波形及基本特性与冰冻切片一致,但脑片培养方法的细胞突触后电流幅度更大、频率更高。结论:脑片培养可修复受损纤维和细胞膜柔韧性,且不改变膜特性,但脑片培养重建了一定数量的细胞间信号连接,使细胞反应性增强,脑片培养方法更适合脑片神经元研究。     

丙泊酚对老年大鼠的认知功能障碍及海马神经元凋亡的影响

摘要 目的：探讨丙泊酚对老年大鼠的认知功能障碍及海马神经元凋亡的影响。方法：选择45只老年大鼠随机分为3组,包括对照组、七氟烷组、联合组,七氟烷组吸入1.5%七氟烷,吸入频次为1 h/d;联合组则给予1.5%七氟烷、丙泊酚注射液150 mg/kg,对照组则等量注射氯化钠溶液,3组均进行为期2周的给药时间。进行Morris水迷宫试验,对海马神经元凋亡蛋白,血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平,PI3K/Akt/ mTOR通路蛋白相对表达予以检测。结果：Morris水迷宫试验2、3 d时潜伏期、游泳距离比Morris水迷宫试验1 d时缩短,七氟烷组Morris水迷宫试验1、2 d时潜伏期比对照组延长,Morris水迷宫试验1、2 d时游泳距离比对照组延长,联合组第1、2、3 d潜伏期比七氟烷组缩短,游泳距离比七氟烷组缩短（P<0.05）;与对照组相比,七氟烷组Bax蛋白、Capase-3蛋白相对表达水平升高,Bcl-2蛋白相对表达水平下降;与七氟烷组相比,联合组Bax蛋白、Capase-3蛋白相对表达水平下降,Bcl-2蛋白相对表达水平上升（P<0.05）;七氟烷组血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平比对照组高,联合组血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平比七氟烷组低（P<0.05）;七氟烷组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR通路蛋白相对表达比对照组低,联合组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR通路蛋白相对表达比七氟烷组高（P<0.05）。结论：丙泊酚可有效缓解七氟烷引起的老年大鼠神经受损状况,其与该药物通过对炎症反应与海马细胞凋亡的抑制,对PI3K/Akt/ Mtor信号通路进行激活有关。     

维生素D对高脂诱导的2型糖尿病大鼠海马神经元损伤的影响

目的:观察活性维生素D3腹腔注射对2型糖尿病大鼠海马神经元的影响。方法:SD大鼠30只,随机分为空白对照组(Control),高脂组(HF),高脂+VD组(HF+VD),糖尿病组(DM),糖尿病+VD组(DM+VD)。测定大鼠空腹血糖、胰岛素、维生素D等生化指标,应用透射电镜观察海马神经元结构变化。结果:与对照组相比,HF组、HF+VD组大鼠体重增加,(分别为343.28±10.41 g;356.81±36.20 g和360.18±25.56g),DM组体重降低(265.6±16.11 g)(P0.05);DM组SDF-1为398.33±15.01 ng/L,低于Control组(457.53±26.56 ng/L),骨化三醇干预后SDF-1显著升高(448.54±36.83 ng/L)(P0.05);DM组(25-OH-D)水平为165.25±30.75μg/L,低于Control组213.65±30.79μg/L,补充骨化三醇后显著提高至210.31±50.69μg/L(P0.05);DM组海马神经元CXCR4表达降低,线粒体可见明显肿胀,DM+VD组线粒体形态明显改善,海马神经元CXCR4表达水平明显升高。结论:常规量补充维生素D可提高糖尿病大鼠体内维生素D水平,对海马神经元有明显保护作用。     

人参皂苷Rg1对抑郁症大鼠抑郁行为和海马神经元损伤、PKA、PKC的影响

摘要 目的：探讨与分析人参皂苷Rg1对抑郁症大鼠抑郁行为和海马神经元损伤、蛋白激酶A（PKA）与蛋白激酶C（PKC）的影响。方法：抑郁症大鼠48只随机平分为三组-模型组、实验1组、实验2组,每组16只大鼠。实验1组、实验2组每天2次灌胃给药（1 mg/mL、4 mg/mL人参皂苷Rg1）,给药体积为10 mL;模型组以相同方式按体重给予双蒸水。观察与记录鼠抑郁行为和海马神经元损伤、PKA、PKC表达变化情况。结果：实验1组、实验2组治疗第7 d、第14 d的逃避潜伏期都显著低于模型组,实验2组与实验1组相比也显著缩短（P<0.05）。实验1组、实验2组治疗第7 d、第14 d的糖水偏好率高于模型组,实验2组与实验1组相比也显著升高（P<0.05）。实验1组、实验2组治疗第7 d、第14 d的血清5-羟色胺较模型组高,血清皮质酮含量较模型组低,实验2组与实验1组对比也有明显差异（P<0.05）。实验1组、实验2组治疗第7 d、第14 d的海马神经元组织的PKA、PKC蛋白相对表达水平显著低于模型组,实验2组与实验1组相比也显著缩短（P<0.05）。结论：人参皂苷Rg1在抑郁症大鼠的应用能改善抑郁行为,增加糖水偏好率,降低逃避潜伏期,还可提高大鼠的血清5-羟色胺含量,降低血清皮质酮含量,降低海马神经元组织的PKA、PKC蛋白表达水平。     

腹侧被盖区多巴胺神经元全脑神经环路示踪

摘要 目的：研究小鼠中脑腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元接受的全脑输入性上游投射及其输出性下游投射,解析其全脑上下游神经环路连接。方法：用立体定位仪将辅助病毒AAV-EF1a-DIO-GT和AAV-EF1a-DIO-G的混合液（1：1）注射到DAT-cre转基因小鼠的VTA脑区,2周后将重组狂犬病毒（RV）EnVA-RV-mCherry微注射到VTA脑区,1周后RV病毒完成逆向跨突触感染并充分表达荧光蛋白,全脑冰冻切片,用全自动扫描荧光显微镜全脑拍片。用立体定位仪将顺行示踪病毒AAV-EF1a-DIO-GFP微注射到DAT-cre转基因小鼠的VTA脑区,2周后待病毒及荧光蛋白充分表达后,全脑冰冻切片,VTA区脑片用TH抗体行免疫荧光染色,全自动扫描荧光显微镜全脑拍片。结果：狂犬病毒逆向跨单级突触示踪结果显示,全脑许多脑区核团神经元表达RV病毒携带的红色荧光蛋白,主要包括前脑皮层、纹状体、伏隔核、下丘脑视前区、外侧下丘脑、下丘脑室旁核、杏仁核、腹侧被盖区、黑质、中缝背核、臂旁核、缰核。顺行示踪病毒结果显示,表达绿色荧光蛋白的纤维投射主要集中在内侧前额叶皮层、纹状体、伏隔核、背外侧隔核、杏仁核、外侧下丘脑几个脑区。结论：VTA多巴胺能神经元的上游输入性投射广泛的分布于全脑,包括前脑皮层、基底神经节区、下丘脑区、边缘系统、中脑的许多核团都向其发出纤维投射。VTA多巴胺神经元的下游输出性投射主要集中在基底神经节的伏隔核和纹状体,内侧前额叶皮层及下丘脑也有一定投射。     

miR-34a在幼鼠海马神经元细胞增殖和凋亡中的作用

目的:探讨miR-34a在幼鼠海马神经元细胞增殖凋亡中的作用。方法:分离幼鼠海马神经元细胞,转染miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor)、抑制剂对照(inhibitor control)、miR-34a模拟物(miR-34a mimics)、模拟物对照(mimics control),RT-PCR检测细胞中miR-34a表达水平。MTT检测转染后细胞增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Western blot检测细胞中Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平。结果:转染miR-34a inhibitor可以抑制miR-34a的表达,miR-34a mimics可以促进miR-34a的表达。miR-34a mimics对细胞增殖抑制率明显高于mimics control组(P0.05),miR-34a inhibitor组抑制率明显低于inhibitor control组(P0.05)。miR-34a inhibitor组神经元细胞凋亡率明显低于inhibitor control组(P0.05),miR-34a mimics组神经元细胞凋亡率明显高于mimics control组(P0.01),inhibitor control组和mimics control组神经元细胞凋亡率差异不显著(P0.05)。miR-34a inhibitor组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达量低于inhibitor control组,差异显著(P0.05);miR-34a inhibitor组Bcl-2蛋白表达量高于inhibitor control组,差异显著(P0.05);miR-34a mimics组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达量高于mimics control,差异显著(P0.05);miR-34a mimics组Bcl-2蛋白表达量低于mimics control,差异显著(P0.05)。结论:miR-34a抑制海马神经元细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax表达有关。     

博尔纳病病毒感染对神经元可塑性影响的研究进展

博尔纳病病毒(Borna Disease Virus,BDV)是一种具有高度嗜神经性的病毒。近年,有大量研究证实该病毒感染与人神经精神疾病的发生有关。但其确切机制仍未明了。一些研究认为BDV感染对中枢神经系统神经元可塑性的影响可能是其致病的重要基础。近年许多学者通过对沙鼠、小鼠、大鼠及转基因鼠等各种BDV感染模型的研究,进一步揭示了BDV感染对神经元可塑性影响的分子机制。结果发现BDV感染主要通过对星形胶质细胞功能的影响、干预HMGB 1蛋白以及神经营养因子信号转导等途径干预神经元的可塑性,影响脑内神经元的功能及其存活和发育,从而引起脑功能损害,导致宿主精神、行为异常。今后随着新的BDV转基因模型的成功建立将进一步揭示BDV感染对神经元可塑性影响的分子机制,给临床预防和治疗博尔纳病提供理论基础。     

锌离子调节皮质酮对原代培养大鼠海马神经元的损伤

探讨皮质酮对原代培养大鼠海马神经元的损伤效应及锌的调节作用。用原位染色和RT-PCR方法,分别检测神经元的损伤情况及NMDA受体三种亚基(NRl、NR2A、NR2B)mRNA的表达。皮质酮(5μmol／L)作用2,4h可明显降低海马神经元的存活率,导致神经元凋亡,并随着作用时间的延长而加重;锌离子明显影响皮质酮对海马神经元的损伤效应：同时加入皮质酮和低、中浓度Zn^2 (10、100μmol／L),可明显降低神经元凋亡率,而加入高浓度Zn^2 (250μmol／L)则加重神经元损伤。皮质酮作用24h后,海马神经元NRl、NR2BmRNA的表达水平增高,而同时加入低、中浓度Zn^2 (10、100μmol／L)的海马神经元NRl、NR2BmRNA表达水平与对照组接近;NR2AmRNA表达无明显变化。这些结果表明,锌对皮质酮所致应激损伤的调节具有双向性;NMDA受体亚基水平的变化可能是其中重要环节之一。     

雌激素对多巴胺能神经元功能调节作用的研究进展

帕金森病（Parkinson‘s disease,PD)是中枢神经系统多巴胺（Dopamine,DA) 能神经元退行性疾病,其发病率具有明显的性别差异。性腺类固醇激素,尤其是雌激素,可在垂体、下丘脑、中脑边缘系统和黑质－纹状体（nigrostriatal,NS)系统等水平影响DA能神经递质系统的功能。而且,雌激素的使用剂量和时间的不同,可影响DA能神经元的活性。本文就雌激素与DA的关系及PD发病具有性别差异方面的新近进展作简要概述。     

线粒体大麻素受体1在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响

目的:探讨线粒体CB1受体(mitochondrial cannabinoid receptor1,mtCB1)在大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中对线粒体分裂的影响。方法:原代培养新生的Wistar大鼠海马神经元,将培养至第8天的海马神经元采用随机数字表分为5组(n=60):正常组(N组):正常培养,不做任何处理;缺氧复氧组(H/R组):采用氧糖剥夺法构建海马神经元缺氧复氧损伤模型,缺氧6h,复氧20 h;缺氧复氧组+ACEA+AM251组(H/R+ACEA+AM251组):缺氧6 h结束后立即加入ACEA和AM251,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+ACEA+Hemopressin(H/R+ACEA+Hemo组):缺氧6h结束后立即加入ACEA和Hemopressin,终浓度分别为1μmol/L、10μmol/L,复氧20 h;缺氧复氧+赋形剂组(H/R+V组):同样于缺氧6h结束后立即加入二甲基亚砜(DMSO),终浓度0.1%,复氧20 h。使用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca~(2+)的浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡诱导因子(AIF)、线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1,细胞凋亡相关蛋白细胞色素C(Cytc)和Rho相关的卷曲蛋白激酶1(ROCK1)的表达。结果:与N组相比,H/R组、H/R+ACEA+AM251组、H/R+ACEA+Hemo组和H/R+V组的细胞内Ca~(2+)浓度、细胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表达水平均明显增加(P0.05);与H/R组相比,H/R+ACEA+Hem组上述各检测指标明显降低(P0.05),H/R+ACEA+AM251组和H/R+V组各指标比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:线粒体CB1受体(mtCB1受体)可能通过降低细胞内ROS的含量来减少细胞内Ca~(2+)浓度和ROCK1的表达,进而抑制线粒体分裂,并最终减轻海马神经元缺氧复氧损伤。     

Extracellular Somatostatin Measured by Microdialysis in the Hippocampus of Freely Moving Rats: Evidence for Neuronal Release

Abstract: Intracerebral microdialysis combined with a sensitive and specific radioimmunoassay was used to monitor the neuronal release of somatostatin (somatostatin-like immunoreactivity, SLI) in the dorsal hippocampus of freely moving rats. The sensitivity of the radioimmunoassay was optimized to detect <1 fmol/ml. The basal concentration of SLI in 20-min dialysate fractions (5 μl/min) collected 24 h after probe implantation was stable over at least 200 min. The spontaneous efflux dropped by 54 ± 6.4% ( p < 0.05) when Ca²⁺ was omitted and 1 m M EGTA added to the Krebs-Ringer solution and by 65.5 ± 3.2% ( p < 0.05) in the presence of 1 μ M tetrodotoxin. Depolarizing concentrations of the Na⁺ channel opener veratridine (6.25, 25, 100 μ M ) induced 11 ± 2 ( p < 0.05), 17 ± 2 ( p < 0.05), and 21 ± 5 ( p < 0.01) fold increase in SLI concentration, respectively, during the first 20 min of perfusion. The effect of 100 μ M veratridine was blocked by coperfusion with 5 μ M tetrodotoxin ( p < 0.01) and reduced by 79% ( p < 0.01) in the virtual absence of Ca²⁺. Neuronal depolarization by 20 min of perfusion with Krebs-Ringer solution containing 25 and 50 m M KCl and proportionally lowered Na⁺ increased the dialysate SLI 4.4 ± 1 ( p < 0.05) and 17 ± 3 ( p < 0.01) fold baseline, respectively. Ten micromolar ouabain, a blocker of Na⁺,K⁺-ATPase, increased the dialysate SLI 15-fold baseline, on average ( p < 0.05), during 80 min of perfusion. The results demonstrate the suitability of brain microdialysis for monitoring the neuronal release of SLI and for studying its role in synaptic transmission.     

Homeostatic Plasticity in the Hippocampus Facilitates Memory Extinction

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca²⁺ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca²⁺ events using confocal microscopy. In essence, a “calcium roadmap” is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.     

神经元的突触可塑性与学习和记忆

大量研究表明,神经元的突触可塑性包括功能可塑性和结构可塑性,与学习和记忆密切相关.最近,在经过训练的动物海马区,记录到了学习诱导的长时程增强(long term potentiation,LTP),如果用激酶抑制剂阻断晚期LTP,就会使大鼠丧失训练形成的记忆.这些结果指出,LTP可能是形成记忆的分子基础.因此,进一步研究哺乳动物脑内突触可塑性的分子机制,对揭示学习和记忆的神经基础有重要意义.此外,在精神迟滞性疾病和神经退行性疾病患者脑内记录到异常的LTP,并发现神经元的树突棘数量减少,形态上产生畸变或萎缩,同时发现,产生突变的基因大多编码调节突触可塑性的信号通路蛋白,故突触可塑性研究也将促进精神和神经疾病的预防和治疗.综述了突触可塑性研究的最新进展,并展望了其发展前景.     

Mitochondrial Regulation of Neuronal Plasticity

The structure and function of neurons is dynamic during development and in adaptive responses of the adult nervous system to environmental demands. The mechanisms that regulate neuronal plasticity are poorly understood, but are believed to involve neurotransmitter and neurotrophic factor signaling pathways. In the present article, I review emerging evidence that mitochondria play important roles in regulating developmental and adult neuroplasticity. In neurons, mitochondria are located in axons, dendrites, growth cones and pre- and post-synaptic terminals where their movements and functions are regulated by local signals such as neurotrophic factors and calcium influx. Mitochondria play important roles in fundamental developmental processes including the establishment of axonal polarity and the regulation of neurite outgrowth, and are also involved in synaptic plasticity in the mature nervous system. Abnormalities in mitochondria are associated with neurodegenerative and psychiatric disorders, suggesting a therapeutic potential for approaches that target mitochondrial mechanisms. Special issue dedicated to John P. Blass.     

假性高血压的研究进展

高血压是心脑血管疾病重要的危险因素,可损伤重要脏器如心、脑、肾的结构和功能,最终导致这些器官的功能衰竭,是危害人类健康的一大杀手。假性高血压(Pseudohypertension,PHT)是指普通袖带测压法所测血压值高于动脉穿刺直接测得的血压值的一种特殊现象,也是难治性高血压的一个主要原因。已有研究表明,假性高血压在老年人、动脉硬化、肾功不全及糖尿病患者中较为多见。目前国内外有限的研究显示假性高血压发病率1.7%-50%。在临床治疗中如不能准确识别假性高血压而对患者行过度降压治疗,将会造成严重的灌注不足事件如中风,甚至死亡。因此,假性高血压日益受到重视,本文就其诊断标准、产生机制、流行病学等方面作一综述。     

神经病理性疼痛大鼠海马miRNA差异性表达研究

目的:探讨神经病理性疼痛大鼠海马差异性表达的miRNAs,并预测其在神经病理性疼痛发病机制中的作用。方法:通过建立L5神经结扎横切(L5 Spinal Nerve Transection,L5-SNT)所致神经病理性疼痛大鼠模型,在机械痛阈检测结束后处死大鼠,剥离海马组织,提取miRNA进行测序,找出L5-SNT大鼠海马差异表达的miRNAs,并对其进行靶基因预测及功能分析。结果:L5-SNT大鼠模型建立成功,手术侧足底机械痛阈明显低于正常组和假手术组大鼠(P0.05)。miRNA测序结果显示:L5-SNT组的大鼠海马miRNAs发生明显的差异性表达,其中显著下调的为:rno-miR-30c-2-3p、rno-miR-370-3p、rno-miR-541-3p、rno-miR-22-3p(P0.05);显著上调miRNAs为:rno-miR-32-5p(P0.05);对上述差异性表达明显的miRNAs进行靶基因预测及功能分析,推测与海马神经病理性疼痛有关的靶基因有:Mapk14、Camk2b、Ntrk2、Cxcl12。结论:L5-SNT大鼠海马的差异性miRNAs及其靶基因功能可能主要与海马MAPK信号通路、长时程增强、炎症反应及细胞周期有关。     

创伤后应激障碍大鼠海马与前额叶皮质中OREXIN受体的失调

目的:从食欲素(Orexin, ORX)系统挖掘创伤后应激障碍的神经生物学机制。方法:以单次延长刺激(single prolonged stimulation,SPS)法复制创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder,PTSD)大鼠模型,以行为学结合血清中皮质酮和神经元特异性烯醇化酶进行模型评价,通过酶联免疫吸附试验(Elisa)分析大鼠血清与脑脊液中OREXIN水平,以实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测海马与前额叶皮质中的Orexin受体基因表达。结果:实验成功的复制了PTSD模型,与对照组相比,模型组大鼠血清中皮质酮和神经元特异性烯醇化酶的含量均极显著升高(P0.01),脑脊液中Orexin A、Orexin B的含量均显著升高(P0.01),海马和皮质中ORX1R与ORX2R均极显著下降(P0.01)。结论:PTSD大鼠的应激损伤与Orexin及其受体表达水平的变化密切相关。     

轻度认知障碍的研究进展

老年性痴呆(阿尔茨海默病,Alzheimer disease,AD)是目前严重影响老年人生存质量的疾病,且疗效不佳。据推测到2050年阿尔茨海默病的患病率将是现今的三倍。轻度认知障碍(mild cognitive impairment,MCI)是介于阿尔茨海默病和正常衰老之间的一种认知功能损害状态,是发生阿尔茨海默病的高危因素。文献报道轻度认知障碍每年以8%-25%的比例进展为阿尔茨海默病,较正常人群阿尔茨海默病发病率高10倍。与阿尔茨海默病病理损害不可逆相比,轻度认知障碍患者通过早期干预治疗,可延缓或阻止病情发展为阿尔茨海默病。因此,对阿尔茨海默病早期出现的轻度认知功能障碍诊断及干预尤为重要。本文就认知功能早期阶段,轻度认知功能障碍的历年(2000年到2014年3月)研究进展从概念及分型、临床表现、诊断标准、病理生理及其影像学研究、危险因素及其预防、干预措施(药物和非药物)等方面的最新进展进行论述。     

慢性疼痛治疗的研究进展

慢性疼痛是临床常见的病症,给患者和社会都带来极大的负担。其发病机制受生理、心理和社会等多种因素的影响较为复杂,因此,慢性疼痛的治疗一直是临床上的一大难题。单一的治疗手段往往不能取得令人满意的效果,目前常采用多手段联合的方式来治疗慢性疼痛,常见的包括药物治疗、心理治疗、介入治疗以及自我管理等。针对不同类型的慢性疼痛甚至同一类型的不同病人其治疗方案也不尽相同,近年来兴起的跨学科康复计划为慢性疼痛的治疗指明了方向。本文就慢性疼痛治疗的研究进展进行了综述,以期为临床实践提供更多参考和理论依据。