探测微生物多样性的新方法

科学家估计,目前大约只有不到1%的微生物能被纯培养,由于纯培养手段的局限,现在已相继发展有多种不同的方法用于探测微生物世界的多样性,如原位检测特异性的基因、基因组的分析,但这些研究方法对科学家认识微生物生态系统中的个体成员帮助不大。7月9日霍华德休斯医学研究所(HHM     

自然界中不可培养微生物的研究进展

尽管微生物培养技术已经发展了几十年,但是环境中可培养的微生物比例仍然较低。目前研究者对微生物不可培养的原因有了进一步的了解,其关键在于：高浓度的营养基质、无法实现原位培养、不明确环境中微生物之间的相互作用、缺乏尖端的微生物检测方法等。研究者为了克服这些培养障碍,不断研究出许多提高微生物培养效率的方法,简要介绍改进培养基、发展新的培养条件等提高微生物可培养性的方法。     

单细胞尺度下的微生物学研究:意义与方法

最近研究表明,即便是处于同一种群中的微生物细胞,在基因转录和翻译、蛋白活性、以及代谢物丰度等多个水平都可能存在显著差异,说明微生物细胞间存在着多个层次上的异质性;同时,传统微生物学研究方法需要将所研究的微生物对象在实验室实现再次培养,然后对纯培养的微生物种群进行研究,这样往往造成实验室的研究结果无法真实地反映微生物细胞在自然界中的原始状态,急需发展新的原位研究手段;此外,自然界中的微生物目前只有极少部分可以在实验室中进行培养,仍有大量微生物无法通过传统方法进行发掘和研究。单细胞尺度微生物学为解决这些微生物学研究中的重要挑战提供了一种新的策略和技术思路,有望帮助我们更为直观、深入地了解每个细胞内部的状态,以及其在自然界的生理生态功能。本文对单细胞尺度微生物学研究的意义以及当前单细胞尺度微生物学的研究方法,特别是新兴的微生物单细胞组学方法进行了介绍。     

微生物组学的技术和方法及其应用

微生物组是指一个特定环境或生态系统中全部微生物及其遗传信息的集合, 其蕴藏着极为丰富的微生物资源。全面系统地解析微生物组的结构和功能, 将为解决人类面临的能源、生态环境、工农业生产和人体健康等重大问题带来新思路。然而, 微生物组学研究在很大程度上取决于其技术与方法的发展。在高通量测序技术出现以前, 微生物研究主要基于分离培养和指纹图谱等技术, 然而, 由于这些技术存在的缺陷, 人们对于微生物的认识十分有限。自21世纪初以来, 尽管高通量测序和质谱技术的革命性突破极大地促进了人们对于微生物的认识, 微生物组学技术在微生物组研究中的应用仍面临着诸多挑战。此外, 目前微生物组的结构和多样性等描述性研究已臻成熟, 微生物组学研究正处于从数量到质量、从结构到功能的关键转变时期。因此, 该文首先介绍了微生物组学的基本概念及其发展简史, 其次简述了微生物组学研究的相关技术和方法及其发展历程, 并进一步阐述了微生物组学的技术和方法在生态学研究中的应用及存在的主要问题, 最后从技术、理论和应用层面阐述了未来微生物组学技术和方法发展的前沿方向, 并提出了今后微生物组学研究的优先发展领域。     

未培养微生物研究策略概述

基于未培养微生物数量巨大、种类繁多、基因资源丰富等特点。扼要介绍了未培养微生物的纯培养分离策略和分子生物学研究方法。随着新型培养策略如原位仿生境培养、限制性培养、单细胞微操作等的出现,使未培养微生物的纯培养成为可能。同时由于宏基因组学和高通量DNA测序等现代分子生物学方法技术的逐渐成熟,使来源于未培养微生物的新基因和新活性物质的分离筛选出现了新的机遇与挑战。     

核糖体RNA测序技术在海洋微生物多样性研究中的应用

海洋微生物总数高达10~(30)个,在海洋生态系统中发挥着驱动能量物质循环和维持生态平衡的重要作用。深入研究海洋微生物多样性有助于理解海洋生态系统运行机理、应对全球海洋生态危机,以及开发海洋微生物资源。由于目前可培养分离的海洋微生物种类极少,极大限制了对海洋微生物群落、丰度和生理生态特征的研究。核糖体RNA测序技术以较低的成本,根据遗传信息差异对微生物快速准确地进行分类鉴定,揭示群落结构、评估进化和生态学关系。近年来基于核糖体RNA序列测序分析的海洋微生物学研究随着测序技术本身的快速优化,在发现海洋微生物新类群,揭示海洋微生物生态规律,分析海洋微生物进化关系,以及与海洋微生物相关的代谢产物开发和海洋生态治理等研究中取得显著进展。本综述详细介绍了核糖体RNA序列测序技术的原理,各代测序技术在海洋微生物多样性研究中的应用,以及多种建库和测序技术的有机结合。最后对研究不同海洋微生物多样性问题提供了测序方案的建议和展望,以期为核糖体RNA测序技术在海洋微生物多样性研究中的应用提供参考。     

长读长测序技术在宏基因组学研究中的应用

由于很多微生物无法单独分离培养,研究微生物群落整体的宏基因组学是目前揭示微生物多样性的重要方法。长读长测序技术可以覆盖重复序列和复杂结构,获得短读长无法检测的基因组信息。现着重介绍了两类长读长测序技术,即基于第三代测序技术的单分子长读长测序技术和基于片段相互联系的合成长读长测序技术,并进一步介绍了长读长测序技术在宏基因组学领域的应用。     

基于高通量测序技术的微生物检测数据分析方法

高通量测序技术的发展正在逐渐改变诸多生物学领域的研究方法.为应对突发疫情以及新发未知微生物威胁的需求,微生物鉴定技术逐渐从传统的物理化学方法及核酸杂交等分子水平方法进一步走向利用无需培养的测序数据进行快速分析检测.随之而来的是对高通量数据分析在精度及速度的要求.基于高通量测序数据的微生物检测数据分析方法在近些年得到了快速的发展.本文分析了目前基于高通量测序数据的微生物检测数据分析方法,对其数据分析的处理流程和计算方法进行了研究,比较了各个微生物检测数据分析方法的特点及适用场景.最后结合本实验室工作总结微生物检测数据分析方法在实际应用中可能遇到的问题,希望对该应用领域的研究有一定的参考意义.     

基于功能基因的微生物碳循环分子生态学研究进展

碳循环是生态系统中重要的生物地球化学元素循环之一。微生物参与碳固定、甲烷代谢、碳降解等多个重要的碳循环过程,深入了解微生物群落在碳循环过程中的功能和作用,有助于获悉微生物对全球气候变化的响应、适应和反馈机制,这也是微生物生态学研究的关键问题之一。传统的研究多集中于微生物分离培养技术,无法覆盖绝大部分未培养微生物,并且无法深入解析碳循环过程中微生物群落的结构和功能,宏基因组学技术的出现克服了这些缺陷,成为研究微生物群落结构和功能的有效手段。本文对目前宏基因组学的主要技术——定量PCR、DNA分子指纹图谱、基因芯片、克隆文库和高通量测序等技术进行了简要介绍,着重介绍了参与碳固定、甲烷生成和氧化、碳降解等主要碳循环过程的关键功能基因的研究现状,最后对碳循环过程中微生物宏基因组学研究的未来发展进行了总结与展望。     

元基因组学方法在环境微生物中的研究进展

新一代测序技术的快速发展,使得元基因组学研究方法成为了理解环境微生物群落结构和相互作用的重要手段之一。元基因组学方法不需要将环境样本中的微生物单独分离培养,而是作为整体进行研究,因而可以回避传统研究时分离培养微生物的困难。基于这一优势,人体、海洋和土壤等环境有关的各项环境微生物测序计划相继启动,并取得了一系列重要的研究进展。探讨了元基因组测序数据分析中所经常采用的方法,以及有关流程的优势和局限性,并进一步讨论了这些方法在各种环境微生物研究中的应用和成果。     

食源性致病菌高通量检测方法及应用

食源性致病菌的体外培养一直是病原体诊断的金标准,但按照目前的培养技术仅有1％的细菌可以培养.目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有:多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、核酸等温扩增技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等,本文介绍了这些高通量检测技术及其在食品病原微生物检测方面的应用情况.     

活性污泥微生物群落宏组学研究进展

活性污泥是全球最常用的废水生物处理人工生态系统,微生物是驱动其污染净化能力的关键。活性污泥微生物群落所有物种与基因(简称"微生物组")的研究先后经历了"显微镜观察和纯菌培养分离"(1915)、"PCR扩增-测序"(1994)和"高通量测序-宏组学分析"(2006)三个重要阶段的发展变迁。相应地,我们对活性污泥微生物组的认知经历了从最早对微型动物(如钟虫和轮虫)及其他微生物的形貌观察和纯种培养鉴定到今天对整个微生物组的全局多样性认识的飞跃。近13年来,基于高通量测序的宏组学方法被广泛应用于揭示活性污泥微生物群落组成结构和功能,我们现在充分意识到活性污泥微生物组蕴藏着大量不可培养新物种和基因多样性,驱动着各类污染物的降解与转化。目前,特异性分子标记基因的扩增子测序技术已经被广泛应用于揭示城市和工业废水处理活性污泥微生物组和典型功能种群(如硝化细菌和聚磷菌)的时空多样性和群落构建机制,进而为未来实现活性污泥微生物组功能的精准调控奠定理论基础。宏基因组学研究在群落、种群和个体基因组水平全面解析了活性污泥微生物组驱动的碳、氮、磷元素循环过程,以及有机微污染物的生物降解和转化机理。将来活性污泥微生物组学研究需要在"标准化的组学分析方法和绝对定量""高通量培养组学""高通量功能基因组学"和"多组学方法的结合及多种方法并用"4个方面取得实现精准生态基因组学所需的技术突破,以最大限度发掘活性污泥微生物组在污水处理与资源回收领域的生态学与工程学价值。     

基于静态和动态数据推断微生物生态网络的理论方法与算法研究进展

微生物群落广泛分布于自然界,在全球能量流动、物质循环以及维持宿主健康方面发挥重要作用。基于高通量测序数据推断微生物群落的分类群间的相互作用是理解和预测微生物群落时间动态行为的关键,所以如何根据不同类型的微生物数据发展对应的生态网络推断方法是研究重点。基于相关文献,该文首先从静态网络和动态网络角度出发,回顾了目前针对微生物各种数据类型发展的生态网络推断方法,理论框架包括对数据的整合处理方法、方法理论介绍以及实现的算法步骤。其次总结了这些推断方法中存在的局限性、不同方法间的关联性、差异互补性以及目前网络推断中遇到的挑战。最后对微生物生态网络推断中未来可能的研究方向进行了展望,为相关研究提供了理论依据。     

分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展

随着分子生物学方法的不断发展和改进,微生物在生态系统中的作用被更好的挖掘出来。目前快速发展的先进的分子生物学技术,已经开始应用于分析环境微生物的多样性、微生物的生物地理学及微生物对气候变化的响应等。一般环境微生物的研究目标主要有3个,即确定微生物的种类和多样性、微生物的功能或潜在作用及在特定时间点活跃的微生物等。然而,现有微生物的研究方法复杂多样,容易给研究者在方法的选择上带来困惑。将从微生物的多样性和功能研究两个方面介绍和分析相应的分子生物学方法,尤其是近年来快速发展的高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法(如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法)等新技术及其应用情况,以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供依据。     

核心微生物组的研究及利用现状

随着分子生物学和生物信息学的飞速发展,新一代测序技术可以轻松地检测不同样本中复杂的微生物分类单元。面对这些复杂而大量的微生物组数据带来的分析挑战,利用核心微生物组的方法来描述和分析样本中的核心微生物组和关键种是近年来新的研究热点,这些结果将揭示与宿主健康、生长和生产等密切相关的微生物种类,有助于深入认识微生物与宿主间的相互关系,深刻理解微生物对宿主的影响作用,更好地理解微生物组在自然生态系统中的功能。本文阐述了核心微生物组的定义、研究方法、与动植物的关系等方面的研究及利用现状,为更好地利用核心微生物组解决环境、人类健康和农业生产问题提供思路。     

16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新,针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物,包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因扩增引物,以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project,EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度,而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外,最近有研究对这些通用引物进行了一些改进,而我们也发现,一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化,简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种,但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导,但在关注具体科学问题时,引物的选择仍需数据指导与实验尝试。     

元蛋白质组分析——研究微生物生态功能的新途径

随着对微生物纯化培养和元基因组学研究的不断深入,积累了大量的微生物基因组信息,元蛋白组分析将促进我们对基因组功能的理解。目前,对微生物群落的元蛋白质组(metaproteome)的研究已成为后基因组时代进一步认识微生物生态功能的有效途径。对这一新技术的介绍结合元蛋白质组的提取和鉴定方法、元蛋白质组在研究微生物生态功能上的应用进行了综述,并对这一新的研究领域所面临的困难与挑战进行了讨论。     

宏基因组方法揭示草地土壤微生物群落响应全球变化

草地在生物圈中发挥着重要的生态服务功能,而草地土壤微生物又是维持生态系统功能和稳定的关键要素之一。过去十几年间,宏基因组方法的进步为微生物群落分析提供了有力的工具。本文综述了宏基因组方法应用于草地土壤微生物群落响应全球变化的最新研究进展,特别是针对气候变化、大气组成变化、土地利用方式改变和外来物种入侵等条件下微生物群落的响应规律和反馈机制的研究。这些研究对于我们认识和了解微生物群落的生态功能十分重要,同时也对维持地球生态系统平衡具有积极的意义。最后,我们对未来应用宏基因组方法研究草地微生物群落进行了展望。     

环境DNA技术在地下生态学中的应用

地下生态过程是生态系统结构、功能和过程研究中最不确定的因素。由于技术和方法的限制,作为"黑箱"的地下生态系统已经成为限制生态学发展的瓶颈,也是未来生态学发展的主要方向。环境DNA技术,是指从土壤等环境样品中直接提取DNA片段,然后通过DNA测序技术来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征。环境DNA技术已成功用于地下生态过程的研究。目前,环境DNA技术在土壤微生物多样性及其功能方面的研究相对成熟,克服了土壤微生物研究中不能培养的问题,可以有效地分析土壤微生物的群落组成、多样性及空间分布,尤其是宏基因组学技术的发展,使得微生物生态功能方面的研究成为可能;而且,环境DNA技术已经在土壤动物生态学的研究中得到了初步应用,可快速分析土壤动物的多样性及其分布特征,更有效地鉴定出未知的或稀少的物种,鉴定土壤动物类群的幅度较宽;部分研究者通过提取分析土壤中DNA片段信息对生态系统植物多样性及植物分类进行了研究,其结果比传统的植物分类及物种多样性测定更精确,改变了以往对植物群落物种多样性模式的理解。同时,环境DNA技术克服传统根系研究方法中需要洗根、分根、只能测定单物种根系的局限,降低根系研究中细根区分的误差,并探索性地用于细根生物量的研究。主要综述了基于环境DNA技术的分子生物学方法在土壤微生物多样性及功能、土壤动物多样性、地下植物多样性及根系生态等地下生态过程研究中的应用进展。环境DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程的研究具有革命性意义,并展现出良好的应用前景。可以预期,分子生物学技术与传统的生态学研究相结合将成为未来地下生态学研究的一个发展趋势。     

转基因作物对土壤微生物多样性影响的研究方法

土壤微生物是土壤生态系统的一个重要组成部分,对土壤中的生物化学循环起着不可替代的驱动作用。转基因作物在生长过程中会不可避免地与土壤微生物发生交流,开展转基因作物对土壤微生物群落影响的研究对于科学评价转基因作物的潜在风险具有重要意义。随着现代生物技术的不断发展,土壤微生物多样性及其分析方法已经从传统的分离培养发展到从种群角度去研究整个土壤微生态系统内的微生物。但是由于土壤微生物的各种特性(如大部分不可培养、体积微小及群体效应等)和仪器设备检测性能的局限性,单一的研究方法会存在一些弊端,还需要结合其他的手段共同研究土壤生态系统中的微生物多样性。目前,人们对土壤微生物多样性的研究主要包括物种多样性、功能多样性、结构多样性及遗传多样性等4个方面,国内外关于转基因作物对土壤微生物多样性及其群落结构影响的研究方法很多,对常见的研究方法进行了总结,并提出了今后转基因作物对土壤微生物多样性及群落结构影响的研究策略。