苦皮藤素V对东方粘虫中肠V-ATP酶AB亚基复合物水解ATP活性的抑制作用北大核心CSCD

苦皮藤素V是一种对昆虫具有毒杀活性的化合物,从植物苦皮藤(Celastrus angulatus Max)中分离出来。目前,已发现苦皮藤素V可与粘虫中肠液泡型ATP酶(V-ATPase)的H、B和a亚基结合,但是其具体作用机理还尚不清楚。本研究将大肠杆菌(Escherichia coli)中表达得到的东方粘虫中肠V-ATPase A亚基突变体TSCA和V-ATPase B亚基包涵体洗涤、溶解后进行复性,获得可溶性AB亚基复合物后采用亲和层析纯化。将纯化好的AB亚基复合物测定H^+K^+-ATPase活性,证明其有ATP水解活性。随后,测定苦皮藤素V对复合物ATPase的抑制活性,发现加入苦皮藤素后,复合物ATPase活性降低。因此,其可能是通过抑制了AB亚基复合物的ATPase活性,从而产生了杀虫效果,证明AB亚基复合物为苦皮藤素V的潜在靶点之一。这为了解苦皮藤素与VATPase相互作用机制打下了基础,也为进一步开发新型杀虫药物奠定了基础。     

豌豆根胞质V1-ATPase的鉴定

利用免疫印迹、免疫电镜和ATP水解活性的测定对豌豆(Pisum sativum L.)根细胞胞质中V1-ATPase复合物的存在进行鉴定.用兔抗绿豆V-type H+-ATPase 的A、B亚基的抗体进行的immuno-blotting和胶体金电镜结果都表明,胞质中存在有A、B亚基.活性测定结果进一步表明胞质具有ATP水解活性.这些结果说明豌豆根胞质具有有活性的V1-ATPase复合物.这是首次直接证明植物中有胞质V1-ATPase的存在.     

玉米根V-ATPase的A亚基磷酸化位点的鉴定

以玉米 (Zea mays L.) 根的高纯度液泡膜为材料进行的磷酸化反应表明,液泡膜蛋白的磷酸化可明显提高V型H -ATPase (V-ATPase) 的ATP水解活性和H 转运活性。进一步研究表明,纯化的液泡膜蛋白能被硫代磷酸化,用V-ATPase的A亚基抗体将一条约69 kD的条带鉴定为A亚基。为了测定V-ATPase的A亚基的磷酸化位点,从硫代磷酸化的凝胶中切下A亚基条带并用胰蛋白酶彻底消化。用RP-HPLC分离纯化酶解片断,收集纯化的硫代磷酸化肽段进行质谱分析所测定的分子量为573.83 Da。A亚基胰蛋白酶彻底消化后能产生61个肽段,只有F56肽段的分子量573.66 Da与573.83 Da最接近,而且F56肽段上只有第525位的丝氨酸可以被磷酸化。因此可以确定,玉米根V-AT-Pase A亚基的潜在磷酸化位点为Ser525。就我们所知,这是首次确定植物V-ATPase A亚基的磷酸化位点。     

大豆液泡膜H~+-ATPase的纯化和重组

通过不连续蔗糖密度梯度离心得到的液泡膜微囊 ,先由胆酸钠和 OG分步破膜抽提、经阴离子交换柱 ( Q- Sepharose)层析分离 .纯化后的酶含 V型 H+ - ATPase的主要亚基 ,与大豆磷脂重组 ,获得了有较高泵活性的脂酶体 .脂酶体的质子泵活性受 Valinomycin激活 ,说明它是致电性的 ,受NO-3 ,DCCD以及特异性的 V型 ATPase抑制剂 Bafilomycin的抑制 .脂酶体的泵活性不受 F型和P型 ATPase抑制剂抑制 ,表明质子转运是由 V型 H+ - ATPase引起的 .     

水稻液泡ATPase B亚基基因的克隆及其在低磷胁迫下的表达特征分析

利用抑制性扣除杂交（SSH）技术构建水稻（Oryza sativa L.）根系饥饿诱导cDNA文库,获得编码液泡ATPase（V-ATPase）B亚基的克隆,通过反转录PCR方法获得该基因的完整序列。该基因编码487个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量为54.06kD,等电点为4.99。Southern印迹表明,V-ATPase B亚基基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在。氮基酸同源性分析发现,V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基,其序列变化伴随生物的进化过程同步进行。Northern印迹表明,V-ATPase B亚基在水稻根系中受到磷饥饿诱导表达,磷饥饿6～12h出现表达高峰,而在叶片中表达有所滞后（24～48h）,在缺磷环境条件下,ATPase B亚基可能通过提高其表达量,进而提高质子转运活性,形成跨膜的电化学梯度,为体内储备磷跨液泡膜运输提供能量,从而提高植物体内磷的利用效率及其耐低磷的能力。     

水稻液泡ATPase B 亚基基因的克隆及其在低磷胁迫下的表达特征分析

利用抑制性扣除杂交(SSH)技术构建水稻(Oryza sativa L.)根系磷饥饿诱导cDNA文库,获得编码液泡ATPase (V-ATPase) B亚基的克隆,通过反转录PCR方法获得该基因的完整序列.该基因编码487个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量为54.06 kD,等电点为4.99.Southern印迹表明,V-ATPase B亚基基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在.氨基酸同源性分析发现,V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基,其序列变化伴随生物的进化过程同步进行.Northern印迹表明,V-ATPase B亚基在水稻根系中受到磷饥饿诱导表达,磷饥饿6～12 h出现表达高峰,而在叶片中表达高峰有所滞后(24～48 h).在缺磷环境条件下,ATPase B亚基可能通过提高其表达量,进而提高质子转运活性,形成跨膜的电化学梯度,为体内储备磷跨液泡膜运输提供能量,从而提高植物体内磷的利用效率及其耐低磷的能力.     

玉米根V-ATPase的A亚基磷酸化位点的鉴定

以玉米(Zea mays L)根的高纯度液泡膜为材料进行的磷酸化反应表明,液泡膜蛋白的磷酸化可明显提高v型H -ATPase(V-ATPase)的ATP水解活性和H 转运活性.进一步研究表明,纯化的液泡膜蛋白能被硫代磷酸化,用V-ATPase的A亚基抗体将一条约69 kD的条带鉴定为A亚基.为了测定V-ATPase的A亚基的磷酸化位点,从硫代磷酸化的凝胶中切下A亚基条带并用胰蛋白酶彻底消化.用RP-HPLC分离纯化酶解片断,收集纯化的硫代磷酸化肽段进行质谱分析所测定的分子量为573.83 Da.A亚基胰蛋白酶彻底消化后能产生61个肽段,只有F56肽段的分子量573.66 Da与573.83 Da最接近,而且F56肽段上只有第525位的丝氨酸可以被磷酸化.因此可以确定,玉米根V-AT-Pase A亚基的潜在磷酸化位点为Ser525.就我们所知,这是首次确定植物V-ATPase A亚基的磷酸化位点.     

豌豆根胞质V1—ATPase的鉴定

利用免疫印迹,免疫电镜和ATP水解活性的测定对豌豆（Pisum sativum L.)根细胞胞质中V1-ATPase复合物的存在进行鉴定。用兔抗绿豆V-typeH^ -ATPase的A,B亚基的抗体进行的immuno-blotting和胶体金电镜结果都表明,胞质中存在有A,B亚基。活性测定结果进一步表明胞质具有ATP水解活性,这些结果说明豌豆根胞质具有活性的V1-ATPase复合物。这是首次直接证明植物中有胞质V1-ATPase的存在。     

家蚕V型ATP酶B亚基的克隆及表达特征

V型ATP酶(Vacuolar-type ATPase)是一种定位于细胞膜和细胞器膜上的氢离子转运酶。它利用ATP水解的能量将氢离子转运到液泡、囊泡或者胞外,从而维持细胞内正常的酸碱环境。V型ATP酶B亚基(V-ATPase B)作为ATP的催化位点,也有着非常重要的作用。为了探讨家蚕V-ATPase B(Bm V-ATPase B)的功能,首先从家蚕五龄幼虫的中肠c DNA中克隆了Bm V-ATPase B基因并构建原核表达载体进行原核表达,获得了重组蛋白,经质谱鉴定正确后,通过镍柱亲和层析的方法纯化了该蛋白并制备了多克隆抗体;最后分析了该蛋白在家蚕丝腺中的表达特征并利用免疫荧光对其在丝腺中的表达位置进行了定位。结果显示Bm V-ATPase B基因序列全长1 473 bp,预测蛋白分子量55 k Da,预测等电点5.3。通过Western blotting对家蚕5龄第3天和上蔟第1天幼虫丝腺的不同区段进行Bm V-ATPase B蛋白的表达特征分析,发现在两个时期该蛋白均在前部丝腺高量表达,而在中部丝腺和后部丝腺表达量相对较低。进一步对两个时期丝腺的不同区段进行免疫荧光定位,发现该蛋白在两个时期的前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺均定位于细胞层。利用激光共聚焦显微镜对该蛋白进行进一步的定位,发现该蛋白主要在丝腺的细胞膜表达。研究结果明确了该蛋白在丝腺中的表达模式,为深入研究该蛋白在蚕丝纤维形成中的作用奠定了基础。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠细胞及其消化酶活性的影响

苦皮藤素V是从杀虫植物苦皮藤Celastrus angulatus Max.根皮中分离的一种对昆虫具有毒杀活性的新化合物。该文通过电镜观察和生化分析研究了其对东方粘虫Mythimnaseparata(walker)幼虫中肠组织及中肠主要消化酶活性的影响。电镜观察发现,中毒试虫的中肠细胞及其细胞器发生明显病变：柱状细胞顶膜微绒毛零乱、减少;线粒体肿胀,出现空白亮区,双层膜不完整;细胞质密度降低,细胞器排列紊乱;内质网池扩张,囊泡化,粗面内质网减少;杯状细胞杯腔变大,微绒毛减少。消化酶活性测定结果表明,中毒试虫中肠的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性和正常虫相比,无显著变化。因此认为,苦皮藤素V主要作用于中肠细胞的质膜及其内膜系统。