人脑内-含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因,以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增,将经琼脂糖DNA电泳 鉴定获得的一约1200bp大小的特异性条带回收,并克隆入Teasy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序. 所得序列进行生物信息学分析BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列,读框分析表明,该序列中存在 一完整编码区,编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白(ACP)样结构域. 随后,经3'RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2024bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子, 15个内含子,该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1 表达载体,经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆人pGEX-4T1表达载体后,转入 JM109宿主菌,经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明,该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析。方法提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上。对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b（＋）载体后转化Origmai B（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。结果对所克隆的Klf4mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b（＋）-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳。结论从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达。     

甘蔗(Saccharum spp.hybrids)木菠萝素(Jacalin)基因的克隆及生物信息学分析

木菠萝素(Jacalin)类凝集素(jacalin-related lectins,JRLs)是一类糖结合蛋白,以家族形式存在于植物中并参与各种生物进程,是植物凝集素超家族中的一类新成员。本研究从甘蔗(Saccharum spp.hybrids)叶片全长c DNA文库中克隆了一个甘蔗木菠萝素基因的c DNA全长序列,命名为Sc JRL(Gen Bank登录号为:KT971368)。Sc JRL全长845 bp,开放读码框长444 bp,共编码147个氨基酸。生物信息学分析显示,Sc JRL推导编码的蛋白为稳定亲水性蛋白,分子量为16.15 k D,预测等电点为6.13。采用实时荧光定量PCR技术,对Sc JRL基因在不同浓度以及不同处理时间的非生物胁迫处理下的表达进行了检测。结果显示,Sc JRL基因分别受Me JA(100μmol/L),SA(5 mmol/L)和H2O2(10 mmol/L)的诱导上调表达,且在处理3 h时表达量已达到最高;Sc JRL基因还分别受到ABA(100μmol/L)和Na Cl(250 mmol/L)的抑制而下调表达,且二者呈现出相同的表达模式。此外,不同处理的H2O2均诱导Sc JRL显著上调表达。当采用中等浓度的外源胁迫处理时,Sc JRL对ABA或Na Cl应答趋势的一致性,以及Sc JRL对SA或H2O2应答趋势的一致性,这说明甘蔗Sc JRL基因作为早期响应基因参与了Me JA和SA信号通路介导的甘蔗防御反应。并且该基因经由SA信号通路正向调控参与了甘蔗应答氧化胁迫,在甘蔗应答抗氧化胁迫机制过程中扮演积极的角色。此外,Sc JRL还经由ABA信号通路介导参与了甘蔗应答盐胁迫,且与ABA信号呈正相关。     

木薯MeASR基因克隆及表达分析

脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白(Abscisic acid-stress-ripening,ASR)在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因Me ASR,序列分析表明该基因开放阅读框(ORF)330 bp,编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域,与番茄ASR家族蛋白Sl ASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明Me ASR定位在细胞核,实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明,Me ASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。     

绿色杜氏藻DHDDS基因生物信息学分析及表达研究

绿色杜氏藻是一种能产生重要次生代谢产物类胡萝卜素的单细胞绿藻,脱氢多萜醇焦磷酸合成酶(dehydrodolichyl diphosphate synthase,DHDDS)是其在类胡萝卜素合成途径中的相关酶。旨在研究DHDDS基因表达与类胡萝卜素含量之间的关系。提取绿色杜氏藻总RNA,通过转录组测序获得DHDDS基因全长,对该基因进行生物信息学分析;并用不同浓度甲基茉莉酸(Me JA)处理绿色杜氏藻,采用实时定量PCR研究该基因转录差异。结果显示,绿色杜氏藻DHDDS基因全长2 211 bp,含有一个1 740 bp长的开放阅读框(ORF),编码579个氨基酸序列。DHDDS蛋白质理论等电点为7.63,相对分子质量为62 472.7 Da。预测结果表明,DHDDS蛋白不含信号肽,也不存在跨膜区域,该蛋白定位于细胞质基质。氨基酸序列比对结果显示,绿色杜氏藻DHDDS蛋白与小球藻的同源性最高(59%)。实时定量PCR结果表明,经100μmol/L Me JA处理的绿色杜氏藻DHDDS表达水平最高,具有极显著差异;在该浓度下,类胡萝卜素含量均高于其他浓度组。且DHDDS基因的表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。绿色杜氏藻DHDDS是一种定位于细胞质基质中的酶,其与绿色杜氏藻类胡萝卜素合成途径有关。在一定浓度范围的Me JA诱导下,低浓度的Me JA对其表达起促进作用,高浓度Me JA对其表达有抑制作用,且其表达与类胡萝卜素含量呈一定的相关性。     

‘云香’水仙NtWRKYY1基因的分离与功能分析

为明确WRKY转录因子在‘云香’水仙中的功能,该研究以‘云香’水仙为材料,克隆了WRKY基因,命名为NtWRKYY1(GenBank登录号为KX056495)。序列分析显示,NtWRKYY1基因开放阅读框(ORF)长度为510bp,编码169个氨基酸。多序列比对和系统进化树分析显示,NtWRKYY1编码蛋白含1个WRKY结构域和C2H2锌指结构(Cx4Cx23HxH),与AtWRKY57聚在一起,属于第Ⅱc类WRKY转录因子。组织表达和时空表达分析显示,NtWRKYY1基因在花中表达量高于根和叶,且在花瓣及副冠中的表达量随开花过程(花蕾期、始花期、盛花期、衰败期)呈上升趋势。植物激素和非生物胁迫分析显示,NtWRKYY1基因受脱落酸(ABA)、高温、干旱和盐诱导,受茉莉酸甲酯(JA)抑制,表明NtWRKYY1基因可能在‘云香’水仙花朵的衰老过程中起正调节作用,同时参与‘云香’水仙ABA、JA等激素信号转导及高温、干旱、盐碱等非生物胁迫过程的调控。利用In-Fusion克隆技术成功构建过表达载体pMDC140-NtWRKYY1,并采用农杆菌介导叶盘法转化烟草。RT-PCR和GUS染色结果显示,目的基因已成功导入烟草基因组中。     

一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1的克隆和特性分析

采用生物信息学方法和5′cDNA末端快速扩增法(RACE)技术相结合,克隆了一个大鼠心肌缺血-再灌诱导表达上调的新基因Mip1,并经RT-PCR测序及多组织膜RNA印迹证实.生物信息学分析显示,MIP-1定位于大鼠染色体1q12区,含5个外显子和4个内含子,开放阅读框(ORF)为1 827 bp,编码608个氨基酸,其编码蛋白N端含KRAB结构域,C端含14个连续的C2H2型锌指蛋白结构域,氨基酸第277位至293位为双向的核定位信号,多组织膜RNA印迹显示该基因在脑组织表达最高,其次是心脏,在其他组织表达较低或无表达.进一步深入研究该基因的功能具有重要生物学意义.     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利用RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHR-I基因(potato Phytophthora infestans-induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA。序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinI有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83％和81％)。Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2、3个拷贝。对其诱导表达模式研究表明：晚疫病病原菌接种36h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCI浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达。该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关。     

猪Opn4基因cDNA克隆与表达分析

为揭示猪Opn4基因的结构并研究其在猪视网膜中昼夜表达差异与生长各阶段表达规律, 文章克隆了猪Opn4基因全长CDS区序列, 定量检测了Opn4基因在猪视网膜中昼夜的表达量以及其在不同生长阶段的表达量。结果表明, Opn4基因编码区序列为1 437 bp, 编码478个氨基酸, 分子式为C2398H3705N623O651S23; Opn4基因在白昼的表达量极显著高于夜晚(P<0.01); Opn4基因在出生前34 d胎儿视网膜中表达量最低(P<0.01); 1日龄时表达量最高(P<0.01); 1月龄、4月龄、84月龄猪视网膜中Opn4表达量差异不显著(P>0.05)。以上结果提示, Opn4基因可参与调控猪的生物节律, 并且Opn4主要参与出生后猪对外界光照的应答。     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHE 1基因(potato Phytophthora infestans induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA.序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinl有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83%和81%).Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2～3个拷贝.对其诱导表达模式研究表明:晚疫病病原菌接种36 h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCl浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达.该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关.     

甘草JAZ基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下的表达分析

甘草(Glycyrrhiza uralensis)是一味大宗中药材，黄酮类活性成分是其主要的药物活性成分之一。茉莉酸是甘草响应非生物胁迫调控类黄酮类活性成分的主要内源激素。JAZ是茉莉酸信号转导途径中的一个重要节点，其通过负向调节茉莉酸的信号转导，参与植物发育、非生物胁迫和对植物激素处理的响应的调节。本研究通过测定聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 6000诱导的干旱胁迫对乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)中茉莉酸(jasmonic acid, JA)含量和JAZ基因家族表达水平以及JAZ基因家族的生物信息学分析，筛选受干旱胁迫诱导JAZ基因。研究结果显示：JA主要在甘草地下部分中积累，干旱胁迫明显提升地下部分JA含量，地下和地上部分中PEG处理2h时JA表达量最高。基于对上述材料的转录组测序数据分析，有10个GuJAZ基因具有完整的读码框，且这些JAZ基因具有时空表达差异性。干旱胁迫诱导地下部分中的GuJAZ基因上调，GuJAZ1、GuJAZ3、GuJAZ4、GuJAZ5、GuJAZ6和GuJAZ10在处理2h组上调最明显...     

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。     

苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

鸭儿芹肉桂酸4-羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析

为研究鸭儿芹木质素合成相关基因,以贵州省野生鸭儿芹为研究对象,克隆到1条1 631bp长的肉桂酸4-羟化酶(C4H)基因(CjC4 H),并以鸭儿芹生长过程中主要面临的4种不同温度(10℃、18℃、30℃和38℃)处理0、0.5、1、2、4、8、12和24h,考察鸭儿芹木质素合成基因CjC4 H的表达情况,探讨鸭儿芹木质素合成基因受温度的调控关系,为鸭儿芹适宜生长温度的选择提供参考。开放阅读框(ORF)分析显示,CjC4 H基因的开放阅读框(ORF)长度为1 521bp,可编码506个氨基酸,蛋白分子质量为58.13kD,等电点为9.38。进化树分析表明,同科植物之间C4H进化上相对保守。实时定量PCR检测鸭儿芹中CjC4 H基因与温度的响应表达,结果表明38℃高温处理4h时,CjC4 H基因表达量远高于其他温度处理;而10℃和18℃相对低温处理,CjC4 H基因表达在24h时明显提高。     

巴西橡胶树转录中介体HbMed25基因克隆与表达分析

转录中介体(mediator,Med)中的Med25基因在植物的组织发育、器官发生、胁迫响应以及调控茉莉酸(JA)信号途径等方面起重要调控作用。该文在巴西橡胶树基因组序列中找到了橡胶树Med25基因的序列,通过RT-qPCR和RACE技术克隆HbMed25基因的全长序列并进行生物信息学预测分析结果显示,HbMed25基因包含2 655 bp的开放阅读框,编码884个氨基酸,蛋白分子量为95 kD,理论等电点为8.68,疏水性蛋白,亚细胞定位最可能为细胞核。Real-time PCR分析结果显示,HbMed25基因在树皮中表达量最高,在植物激素JA处理的形成层和胶乳材料中HbMed25基因在处理早期(1 h和2～4 h)上调表达,受割胶处理HbMed25基因在处理早期上调表达且对高产的橡胶树品系(CATAS 8-79和CATAS 7-33-97)的割胶处理响应更明显。综上结果认为,HbMed25基因极大可能参与了JA信号途径的调控,对阐明JA诱导橡胶树次生乳管分化的分子调控机制具有促进作用。     

小麦F-box/Kelch类基因TaFKOR23的抗逆相关表达模式及分子互作蛋白鉴定

为了解F-box成员在小麦中响应生物和非生物逆境的表达情况及作用机制,本研究自小麦抗叶锈病近等基因系Tc Lr15中克隆了F-box基因Ta FKOR23,该基因编码一个由421个氨基酸残基组成的蛋白,N端具有F-box结构域,中间带有2个明显的Kelch结构域,属于F-box/Kelch类型基因。系统进化分析表明,Ta FKOR23与粗山羊草(AegilopstauschiiCoss.)和二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)P. Beauv.)中的F-box/Kelch-repeat protein OR23同源性均较高。利用q RTPCR对接种亲和及非亲和叶锈菌、激素处理、非生物逆境胁迫后Tc Lr15植株中该基因的表达模式进行分析。研究结果表明,Ta FKOR23基因表达受叶锈菌侵染而略升高,但在亲和与非亲和组合间的表达量无明显差异;受脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(Me JA)3种激素处理后,该基因均呈先升高后降低的表达趋势,且表达量于处理后12 h达到最高,Me JA对该基因的诱导表达程度略高于SA和ABA;盐胁迫处理后,除了12 h外,Ta FKOR23整体呈现上升的表达趋势,最高表达峰出现在处理后48 h;Ta FKOR23受聚乙二醇(PEG)处理的影响较小;该基因在旗叶中的表达量远高于其他部位。利用酵母双杂交文库筛选并验证与该基因编码蛋白互作的上游靶蛋白。经文库筛选得到11类可能与Ta FKOR23互作的靶蛋白,进一步回转验证及β-半乳糖苷酶检测结果表明Ta FKOR23与小麦S-期激酶相关蛋白(Ta Skp1)、SEC1家族运输蛋白SLY1(Ta SLY1)和几丁质酶2(Ta Chitinase 2)均存在相互作用。研究结果为深入解析小麦中Kelch类F-box基因的功能及代谢网络奠定了基础,并拓宽了对植物中Kelch类F-box基因的功能认识。     

广西巴马小型猪Glut4基因克隆和真核表达

葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是调控肌肉葡萄糖代谢的关键因子。本研究旨在克隆广西巴马小型猪Glut4基因,构建真核表达载体,转染C2C12细胞,研究Glut4功能。以广西巴马小型猪背最长肌组织作为实验材料,通过RT-PCR技术扩增出Glut4基因编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,测序鉴定正确后提取克隆质粒。用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切克隆质粒,获得Glut4片段,连接至p EGFP-N1载体上,构建p EGFP-N1-Glut4表达载体,提取p EGFP-N1-Glut4重组质粒转染至C2C12细胞,观察细胞荧光表达情况,并检测转染24 h和48 h时培养液的葡萄糖水平。实验结果表明:广西巴马小型猪Glut4基因编码区序列长1 530 bp,编码509个氨基酸,与参考序列(序列号为EU590115.1)的同源性为99.7%;重组质粒转染C2C12细胞能表现出绿色荧光。转染24 h和48 h时,p EGFP-N1-Glut4组细胞培养液的葡萄糖浓度均显著低于空载体组(16.08±0.49 vs.17.13±0.13,4.93±0.19 vs.6.28±0.12,p0.01)。在C2C12成肌细胞中过表达广西巴马小型猪Glut4基因,能增加细胞的葡萄糖摄入量。     

人脑内一含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因，以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增, 将经琼脂糖DNA电泳鉴定获得的一约1 200 bp大小的特异性条带回收，并克隆入T easy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序.所得序列进行生物信息学分析：BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列，读框分析表明，该序列中存在一完整编码区，编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白（ACP）样结构域.随后，经3′RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2 024 bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子，15个内含子，该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物，从T easy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1表达载体，经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆入pGEX-4T1表达载体后，转入JM109宿主菌，经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明，该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

棉花4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆及原核表达

本研究从棉花中克隆了一个4CL基因,命名为Gh4CL2(GenBank登录号为FJ848870)。研究结果表明:Gh4CL2基因cDNA全长2332bp,具有一个1725bp的开放阅读框,5′非编码区为64bp,3′非编码区为543bp,编码574个氨基酸,预测分子量约为62.106kD,等电点为5.94。氨基酸同源性分析发现,Gh4CL2与来自白杨、大豆和紫草的4CL一致性较高。进一步研究Gh4CL2基因的功能,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-4CL2,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,最佳诱导表达条件为0.5mmol/LIPTG在37℃下诱导4h,重组蛋白主要以包涵体形式出现。     

莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p的克隆及原核表达

[目的]克隆莱茵衣藻缺铁应答基因Femu2p,构建重组表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,优化条件使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。[方法]提取莱茵衣藻CC425的总RNA后,利用RT-PCR和两次重叠延伸PCR相结合的方法获得Femu2p的全长编码区,构建原核表达载体p GEX-6p-1-Femu2p,并将其转入大肠杆菌DL21(DE3)中,利用IPTG诱导融合蛋白的表达并优化表达条件。[结果]Femu2p的全长编码区为2 904 bp,编码967个氨基酸,理论分子量为100.4 k Da,理论等电点为8.86。序列分析结果显示该蛋白属于包含多个C2H2类型锌指结构域的Ran BP2家族。IPTG诱导融合蛋白表达的最佳条件为:IPTG浓度0.25 mmol/L,诱导温度16℃,诱导时间8 h。[结论]成功克隆了Femu2p基因的全长编码区,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。