IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析

[目的]构建不同长度的人claudin-10基因上游启动子荧光素酶报告基因载体,并在LO2细胞中比较其活性。[方法]以人LO2肝细胞基因组DNA为模板,PCR扩增获得claudin-10基因5'侧翼序列,并将其插入p MD18-T载体;PCR扩增获得不同长度的claudin-10基因上游启动子区序列,构建p GL3-Basic系列荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录活性。[结果]成功构建6个不同长度的人claudin-10基因上游启动子区(-1 451/+100bp、-1 022/+100bp、-1 005/+100bp、-677/+100bp、-377/+100bp和-108/+100bp)的报告载体;启动子活性实验结果表明:当claudin-10启动子片段从-1 005 bp截短至-677 bp,从-108 bp截短至+100 bp时活性显著下降(P0.05);其余截短时活性无改变(P0.05)。[结论]claudin-10启动子-1 005bp~-677bp和-108bp~+100bp区是claudin-10基因的主要转录调控区。     

Mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR结合位点的预测及验证

[目的]预测并验证mmu-miR-107与Cacna2d1基因3'UTR的结合位点。[方法]生物信息学预测miR-107与小鼠Cacna2d1基因3'UTR的结合位点,将包含3个靶位点的3'UTR片段克隆至荧光素酶载体p GL3中,构建野生型p GL3-Cacna2d1-WT3'UTR载体;并用重叠延伸PCR技术构建分别含有单个突变位点的载体Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-908和同时含有3个突变结合位点的载体Mut4plus。将各重组质粒与miRNA mimics共转染C2C12细胞,检测荧光素酶活性。[结果]与共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和miR-NC组相比,共转染p GL3-Cacna2d1-WT 3'UTR和mimics-miR-107组荧光素酶活性显著下降(P0.01);与共转染对应的突变体和miR-NC组相比,转染突变体Mut2361-367/Mut3902-908和mimics-miR-107组的荧光素酶活性均下降(P0.05);转染突变体Mut1200-2077/Mut4plus和mimics-miR-107组的荧光素酶活性下降不明显(P0.05)。[结论]Cacna2d1基因3'UTR段双荧光素酶基因报告载体及突变体构建成功,初步证实miR-107与Cacna2d1 3'UTR的200-207位点结合。     

斑马鱼tnfb启动子的克隆和报告基因载体的活性分析

本研究通过采用生物信息学软件预测细胞因子tnfb基因5'上游2 000 bp左右的序列,并预测其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。研究发现tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPα、NF-资B、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。tnfb的启动子区没有发现Cp G岛,其5'侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件。将tnfb的启动子片段插入p GL3-enhancer构建p GL3-tnfb-promoter-enhancer质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;转染了p GL3-tnfbpromoter的Raw264.7细胞的相对荧光素酶活性高于对照组细胞,双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的p GL3-tnfb-promoter-enhancer具有启动子活性。为研究tnfb参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。     

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。     

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究北大核心

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P<0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。     

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。     

强啡肽原基因3'非翻译区多态性位点与海洛因依赖的关联研究

目的:探讨强啡肽原(prodynorphin,PDYN)基因3'非翻译区的3个单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点与海洛因依赖的相关性.方法:严格按照诊断标准,选取无亲缘关系的海洛因依赖患者212例,健康对照200例提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测PDYN基因3'非翻译区rs1022563、rs2235749、rs9100803个多态性位点的基因型,采用HaploView及SPSS11.5软件分析各位点基因型、等位基因频率及组间差异.结果:PDYN基因rs2235749的基因型及等位基因频率分布在海洛因依赖组与正常对照组存在显著性差异(p＜0.01),在海洛因依赖组中等位基因A的频率显著高于正常对照组(p＜0.01).连锁不平衡结果显示,这3个SNPs位点不连锁,D'=0.215.结论:PDYN基因3'非翻译区rs2235749与海洛因相关联,携带有等位基因A的个体可能对海洛因更容易产生依赖.     

萤火虫Luc基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆野生型虫荧光素酶(luciferase)基因(Luc)全长序列并对其进行生物信息学分析。[方法]以虫荧光素酶报告栽体p XP2 DNA为模板,应用PCR技术,获得萤火虫Luc基因目标条带并克隆到p GEM-T-Easy载体,利用CD search、Prot Param、Prot Scale和SOMPA等11种预测软件对其保守区域、一级结构、理化性质、空间结构及活性区域等进行预测分析。[结果]该酶由551个氨基酸残基组成,属于可溶性亲水蛋白。其二级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成。三级结构以6q2m.1的A链为模板进行同源建模,其活性区域由125个氨基酸残基构成,面积和体积分别为2 483.879?2和1 834.454?3。在该蛋白质的活性区域之外,筛选出38个具备引入二硫键条件的潜在位点。[结论]成功克隆了Luc基因,并对野生型虫荧光素酶进行了生物信息学分析预测,为进一步过定点突变提高虫荧光素酶的热稳定性奠定了理论基础。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

FBXO47 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p靶向验证

[目的]构建FBXO47基因3'-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-33b-5p与FBXO47的靶向关系。[方法]采用生物信息学软件预测miR-33b-5p与FBXO47结合位点;利用PCR扩增FBXO47基因3'-UTR序列,将其克隆到GV272载体中,构建FBXO47野生型及突变型双荧光素酶报告质粒;将miR-33b-5p或阴性对照分别与野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR或突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。[结果]酶切及测序结果表明,野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR及突变型GV272-FBXO47-mut 3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性结果表明,相较于对照组,miR-33b-5p可使野生型GV272-FBXO47-wt 3'-UTR的荧光素酶活性降低66%左右;而定点突变GV272-FBXO47-mut 3'-UTR的荧光素酶荧光素酶活性没有显著变化。[结论]成功构建了FBXO47基因3'-UTR的荧光素酶报告基因载体,miR-33b-5p与FBXO47存在靶向性。     

热激蛋白Hsp72促进热休克下HuR对p21CIP1的调控作用

RNA结合蛋白HuR可以结合并调控靶标mRNA稳定性与翻译,但影响HuR 结合活性的因素有待探讨。本研究从蛋白质-蛋白质相互作用角度对影响HuR 与RNA结合活性的因素做了探讨。结果发现,热激蛋白Hsp72在细胞浆与HuR相互作用并促进HuR与p21 (KIP1) 3′UTR（3′非翻译区）的结合; 热休克下Hsp72总蛋白质及细胞浆蛋白质水平上调、但HuR总蛋白质及细胞浆蛋白质水平不变|热休克下HuR与p21 3′UTR的相互作用加强、p21蛋白及mRNA水平上调。上述结果提示,Hsp72可通过与HuR相互作用促进后者与p21 mRNA的结合,进而加强热休克下HuR对p21的表达的促进作用。这些结果为进一步解析HuR的生物学作用机制提供了实验依据。     

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renilla luc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor. 在海肾荧光素酶基因的3′非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3′UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认, 也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.     

构建ECE1 3'UTR荧光素酶报告基因载体验证其与miR-199a-5p靶向关系

目的:通过构建双荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-199a-5p(miR-199a-5p)与ECE1基因的靶向调控关系。方法:通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-199a-5p与ECE1基因3'UTR潜在的互补结合位点,PCR技术扩增ECE1基因3'端非翻译区,将此序列与miR-199a-5p mimics或空质粒(NC)共转染到pmirGLO-ECE1-野生型(WT)的293细胞里;将此序列突变序列与miR-199a-5p mimics或NC共转染到pmirGLO-ECE1-突变型(MUT)的293细胞里,共四组,检测四组细胞中荧光素酶活性。结果:成功构建双荧光素酶报告基因重组质粒pmirGLO-ECE1-WT和pmirGLO-ECE1-MUT。与野生型NC(4.30±0.53)组及突变型miR-199a-5p mimics组(4.465±0.3968)比较,野生型miR-199a-5p mimics组(1.686±0.4098)荧光素酶活性明显降低,P0.05,有显著差异;突变型miR-199a-5p mimics组(4.465±0.3968)与突变型miR-199a-5p NC(4.18±0.498)组及野生型NC(4.30±0.53)组两两比较,P0.05,无明显差异。结论:miR-199a-5p与野生型ECE1存在结合位点,miR-199a-5p对野生型ECE1重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-199a-5p能够靶向调控ECE1基因。     

MiR-381下调Hes1表达调控神经干细胞增殖和向神经元的分化

目的:探讨miRNA-381在神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的体外增殖、分化中的作用及相关机制。方法:采用光镜观察法、免疫组化法对原代获取及诱导分化后的NSCs予以鉴定;QPCR及Western blot法检测miRNA-381、nestin、β-tubulin-Ⅲ和Hes1的mRNA及蛋白表达;CCK-8法检测不同时间点NSCs的增殖情况;荧光素酶报告基因法验证miR-381对Hes1野生型及突变型3'非编码结合区的靶向作用。结果:原代培养细胞呈明显的神经球形态,且高表达nestin蛋白,经b FGF诱导后则高表达β-tubulin-Ⅲ;miR-381转染后,NSCs中miR-381、nestin、β-tubulin-Ⅲ的mRNA和蛋白水平均明显升高(p0.001),免疫荧光法也进一步验证miR-381转染后的NSCs其β-tubulin-Ⅲ的荧光强度显著增强;此外,miR-381转染24 h、48 h及72 h后,NSCs的增殖能力均高于阴性对照组(p24h0.01,p48h0.001,p72h0.001);荧光素酶法结果显示miR-381能显著降低野生型Hes1载体的3'非编码区的荧光素酶活性,而Hes1基因载体的突变型3'UTR的荧光素酶活性不受到miR-381的影响(p0.001);另外,miR-381过表达能明显降低Hes1蛋白的表达;而二者共转染的NSCs增殖能力在转染后24 h、48 h及72 h,均明显低于单纯miR-381转染组(p0.01或p0.001);同时,共转染后β-tubulin Ⅲ的mRNA及蛋白水平均明显低于单纯miR-381转染组(p0.001)。结论:miR-381通过下调Hes1表达促进NSCs的增殖和向神经元的分化。     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).     

白木香树干中的黄酮类成分

从白木香[Aquilaria smensis(Lour.)Gilg]树干的乙醇提取物中分离得到5个黄酮类化合物,经波谱分析,分别鉴定为:洋芹素-7,4'-二甲醚(1)、5-羟基-7,3',4'-三甲氧基黄酮(2)、木犀草素-7,4'-二甲醚p)、芫花素(4)和4',5-二羟基-3',7-二甲氧基黄酮(5).以上化合物均为首次从该种植物树干中分离得到.     

基于模板切换的mRNA5'末端全长扩增方法

本文介绍一种称为CapFinder的技术,可用于克隆基因mRNA序列的5'末端非翻译区全长。该技术是利用某些反转录酶在反转录达到mRNA的5'末端帽结构时表现出很高的加尾活性(主要添加dC)这一特点,在反转录体系中加入一种带GGG的寡核苷酸序列,当反转录反应到达mRNA模板的5'末端帽结构时,切换到以该寡核酸为模板继续进行反转录反应,即可合成完整的cDNA一链,且在其3'末端还带有一段额外的寡核苷酸序列。用GGG寡核苷酸序列为上游引物和基因特异性的下游引物进行PCR即可扩增得到mRNA5'末端非翻译区的全长。利用该技术克隆了棉铃虫幼虫中肠Bt毒素受体E-钙粘素基因的5'末端非翻译区序列。