拟南芥ANAC055基因突变体对高盐和渗透胁迫的响应

高盐和渗透等非生物胁迫是影响农作物产量和品质的重要因素,非生物胁迫发生时,植物通过体内各类转录因子启动胁迫应答反应,进而降低非生物胁迫对植物的损伤。本研究筛选出植物特异性转录因子ANAC055编码基因的纯合T-DNA插入突变体SALK_152738,测序分析发现T-DNA插在ANAC055基因的3'UTR区域。实时荧光定量PCR结果表明叶中ANAC055基因表达量最高;与野生型相比,突变体叶、茎和花中ANAC055基因表达量分别下降了40%、50%和70%。高盐胁迫后,野生型和突变体叶中ANAC055基因表达量分别比对照上升了320%和55.4%;而渗透胁迫时,该基因叶中的表达量分别比对照下降了47.7%和56.3%;电子表达谱分析发现该基因根中的表达可受高盐和渗透等多种非生物胁迫的诱导表达。高盐和渗透胁迫时野生型和突变体幼根的生长均受到明显抑制,但高盐胁迫对突变体根生长的抑制作用比对野生型根生长的抑制作用更大。上述分析表明拟南芥ANAC055基因可受高盐和渗透等非生物胁迫的诱导表达,并且其在拟南芥幼根的生长发育过程中具有一定的作用,本研究有助于进一步明确其在非生物胁迫过程中的作用。     

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

拟南芥CKL3基因表达对非生物胁迫的响应

以拟南芥为材料,采用PCR和RT-PCR技术在DNA和RNA水平上鉴定出了与CKL3基因对应的T-DNA插入纯合突变体,并对其表型变化进行了观察.半定量RT-PCR检测CKL3基因在拟南芥不同器官和非生物胁迫响应中表达的结果表明,CKL3基因在根、花、叶中表达较高,在茎、叶柄中表达较弱;盐胁迫下CKL3基因表达下降,蓝光下CKL3基因表达升高,但热激和红光对此基因表达量的影响不大.     

过量表达GLOase导致转基因拟南芥中维生素C含量和抗逆能力提高

L-古洛糖酸-1,4-内酯氧化酶（L-gulono-1,4-lactone oxidase,GLOase）是维生素C合成途径中最后一步关键酶,小鼠（Musmusculus）编码GLOase的gulo基因转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）的转基因株系中维生素c含量最高为5．74μmol·g^-1（FW）,是野生型的3．46倍、转p2301空载体对照的3．19倍。30％聚乙二醇（PEG-6000）模拟干旱胁迫的不同时间梯度中,幼苗期转基因拟南芥丙二醛含量低于同样处理下野生型和对照组拟南芥。不同NaCl浓度的盐胁迫下,转基因拟南芥在子叶期比野生型、对照组平均根长更长、侧根发育更好;幼苗期莲座叶长势更好、丙二醛含量更低。结果显示过量表达GLOase的转基因拟南芥在维生素c含量提高的同时,抗胁迫能力有所增强。     

杂交方法获得的拟南芥蔗糖转运蛋白基因SUC3/SUC5双突变体及其PCR鉴定

文章以拟南芥T-DNA插入纯合突变体atsuc3和atsuc5为亲本,采用传统杂交技术与PCR鉴定相结合的方法获得了atsuc3/atsuc5纯合双突变体。     

ATHKl基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程

以拟南芥ATHKl基因T-DNA插入所产生的缺失突变体和野生型ws(wassilewskija)生态型为材料,分析了它们在生理和基因表达方面的差异.结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于野生型;在30%PEG-6000胁迫后,野生型和ATHKJ突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50%和80%.PEG胁迫48 h时突变体的萎蔫程度明显大于野生型ws.以上结果说明ATHKl突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型,即ATHKl基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应.利用DDRT-PCR技术研究二者在PEG胁迫36h后的基因表达差异,分离到9个在野生型中被PEG诱导表达而在突变体中未被诱导的参与逆境应答的基因片段,其中包括MAPKKKl8和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,即ATHKJ基因失活引起下游基因响应渗透胁迫的能力减弱,进一步说明ATHKJ基因参与拟南芥适应逆境的调节反应,并且ATHKl可能在逆境信号转导组分MAPK的上游起作用,很可能是植物体中的渗透感受器.     

VHA-c2&c4双基因沉默株系拟南芥对NaCl与ABA的响应

研究液泡H~+-ATPase c亚基基因(VHA-c2和VHA-c4)在植物生长发育及响应非生物胁迫过程中的功能,构建拟南芥VHA-c2c4的RNAi表达载体,通过浸花法转化野生型拟南芥。利用卡那霉素筛选纯合体株系,进行半定量PCR鉴定,并对其进行NaCl和ABA胁迫处理。获得7个T_2代双沉默基因纯合体株系,其VHA-c2和VHA-c4的mRNA表达水平均低于野生型。挑选沉默效率较高的3个株系进行NaCl和ABA处理,在NaCl处理下,它们的主根相对伸长量和种子萌发率均小于对照,表明VHAc2c4沉默株系对NaCl胁迫作用敏感。ABA处理下,子叶的展开程度和主根相对伸长量均比对照高,表明VHA-c2c4沉默株系对ABA抑制作用不敏感。NMT试验表明ABA促进了双沉默基因纯合体株系的H+内流能力。推测VHA-c2和VHA-c4的转录水平影响了植物对盐胁迫和ABA介导的信号转导途径的响应。     

拟南芥ERD15基因缺失突变体的分子鉴定和表型分析

为探究ERD15基因功能,利用反向遗传学,通过PCR及半定量PCR筛选鉴定出拟南芥(Arabidopsis thaliana) ERD15基因的T-DNA插入纯合突变体,并对其表型进行观察分析。结果表明,erd15突变体莲座叶数目显著增多,提前3～4 d开花,突变体比野生型更早从营养生长转向生殖生长。拟南芥野生型植株主茎为圆柱体,平均直径1.29 mm,而erd15突变体主茎扁平,平均直径达到2.27mm,具极显著差异。与野生型相比,erd15突变体果实心皮发育受到影响,隔膜上排列有多排种子,果荚顶端膨大,长度缩短37.67%,但角果平均结籽数升高。因此,ERD15基因参与了调控拟南芥植株的生殖生长过程。     

拟南芥IQM3基因的表达分析及其突变体的鉴定

对拟南芥(Arabidopsis thaliana)IQM3基因的功能进行了分析.结果表明,推定IQM3的启动子中存在多种光、非生物胁迫和植物激素反应的顺式作用元件,可能参与植物对环境变化的反应.RT-PCR分析表明,IQM3在拟南芥莲座叶、花序叶、茎、花和根中的表达较强,但在荚果中的表达很弱;IQM3基因的T-DNA插入突变体iqm3-1和iqm3-2分别是功能缺失和超表达突变体,对这些突变体的表型分析表明,IQM3基因与种子萌发及幼苗子叶膨大有密切关系.     

拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3的PCR鉴定

应用两种植物T-DNA插入突变体PCR鉴定方法,即“三引物法”和“双引物法”对拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3（目的基因两条染色体均发生T-DNA插入的纯合突变体）进行鉴定和比较的结果表明,“三引物法”由于易产生非特异性扩增而无法得到PCR鉴定结果,从而导致鉴定失败;“双引物法”则可避免此种现象,得到可靠、有效的鉴定结果。     

拟南芥耐旱、耐高盐突变体sdt1的获得

在有20000个独立转化株系的拟南芥(Arabidopsis thaliana)激发标签突变体库中,筛选到1 株耐旱、耐盐突变体sdt1(high-salinity and drought tolerant 1)。实验结果表明在连续26d不浇水的干旱胁迫条件下,sdt1可保持正常生长而野生型全部萎蔫死亡。此外,在外施150 mmol/L NaCl水溶液的高盐胁迫条件下．sdt1可正常生长,而野生型全部死亡。在0．5xMS培养基上进行的发芽实验表明sdt1对内源和外施ABA的敏感性均低于野生型,为一个ABA不敏感突变体。对叶片失水率的测定结果表明,在干旱胁迫下sdt1的失水率显著小于野生型。Southern杂交结合sdt1的遗传分析表明该突变体为紧密相邻的2个T-DNA串联插入,对突变的功能基因有待进一步分子鉴定。     

拟南芥CtpA纯合突变体的光合生理特征

以T-DNA插入获得的拟南芥at3g57680基因缺失的CtpA纯合突变体植株为材料,检测了其与光合作用相关的生理特征,以揭示拟南芥at3g57680基因功能和其编码的CtpA蛋白的作用.结果显示:拟南芥的CtpA突变体植株在整个生长过程中都略小于野生型植株,但能够健康生长;CtpA突变体的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和叶绿素a+b值, PSⅠ、PSⅡ和光合电子传递总链的电子传递活性,以及77K低温荧光波谱都与野生型植株无显著差异(P>0.05);CtpA突变体植株的最大光化学量子产量(Fv/Fm)和有效光化学量子产量(ΦPSⅡ)也与野生型无显著差异,而光化学淬灭系数(qP)和非光化学淬灭系数(qN)值在室温下显著低于野生型(P<0.05).研究表明, 拟南芥at3g57680基因在正常条件下对植株生长无显著影响,可能不是编码CtpA蛋白的关键基因.     

拟南芥光形态突变体的筛选与基因鉴定

以哥伦比亚(Columbia)野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料,用含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌浸花进行转化,构建拟南芥T-DNA插入突变体库.通过突变体的筛选和表型分析,获得了两株光形态突变体,子叶下胚轴伸长的光抑制效应减弱.通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced-PCR)技术,成功扩增出突变植株T-DNA插入位点侧翼序列,经NCBI序列比对,T-DNA分别插在CRY1第一和第三外显子部位.突变体的表型分析及PCR鉴定结果表明,T-DNA插入CRY1并影响到突变植株的光形态建成.     

拟南芥agl16突变体的创制及功能鉴定

AGL16是调控拟南芥气孔密度和ABA含量的重要负调控转录因子,在拟南芥抗旱反应过程中发挥重要的作用。为了获取拟南芥agl16突变体材料,采用棉花叶皱缩病毒(CLCrV)介导的VIGE系统筛选靶向敲除拟南芥AGL16的sgRNA,同时利用农杆菌介导的浸花法将完整编辑载体转化野生型拟南芥,创制了拟南芥agl16突变体并进行抗旱性鉴定。结果表明：(1)利用CLCrV介导的VIGE系统筛选获得2个能靶向敲除AGL16基因的sgRNA,同时构建AtU6 26∷AtAGL16 sgRNA1 35S∷Cas9 Ter p1300编辑载体转化野生型拟南芥Col 0,筛选获得靶位点缺失4 bp的agl16纯合突变体(AGL16: 4)。(2)抗旱表型性鉴定结果显示,干旱处理18 d后,大部分野生型植株干枯死亡,而突变体植株受胁迫的表型相对较轻;复水后,野生型和突变体植株的存活率分别为34.5%(10/29)和75%(27/36)。(3)与野生型相比,干旱胁迫下AGL16: 4纯合突变体植株叶片单位面积气孔数量减少、离体叶片失水率显著降低,但二者的单株种子量并没有发生明显的改变。研究认为,AGL16: 4纯合突变体的抗旱性较野生型明显增强,且种子量与野生型基本一致,表明AGL16基因可作为作物抗旱育种理想的候选靶基因;所获得的agl16突变体为后期从农作物中克隆的AGL16同源基因进行功能回补验证提供了有利的转基因受体材料。     

异源表达CkLEA1基因增强了拟南芥对非生物胁迫的耐受性

植物在生长过程中会受到各种非生物胁迫的伤害,导致生长发育和产量受到严重影响,胚胎晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins,LEA蛋白）在植物抵抗非生物胁迫过程中起着重要的保护作用。在前期的研究基础上,将受多种胁迫诱导的柠条锦鸡儿CkLEA1（GenBank登录号KC309408）基因转入野生型拟南芥,通过实时荧光定量PCR从7株T₃代纯合体中筛选出3个转基因株系做进一步研究。种子萌发率实验发现,在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇处理下,转基因株系萌发率均高于野生型拟南芥。干旱处理2周大的幼苗后,转基因株系明显比野生型更抗旱,存活率高于野生型,并且失水率低于野生型。同时,转基因株系积累了较少的丙二醛（MDA）,超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量也高于野生型。这些结果表明,柠条锦鸡儿CkLEA1基因在种子萌发阶段提高了拟南芥对盐和渗透胁迫的耐受性,并且提高了转基因拟南芥幼苗生长阶段对干旱胁迫的抵抗能力。     

拟南芥SPL1基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应

根际酸化是植物适应低磷胁迫的重要策略, 但植物是如何感知和转导低磷信号, 进而促进根际酸化的分子机制至今还不十分清楚。利用pH指示剂(溴甲酚紫)显色法从拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA插入突变体库中分离得到了1株低磷诱导根际酸化缺失突变体spl1。在含溴甲酚紫的低磷培养基上培养8小时, 野生型拟南芥根际培养基的颜色变为黄色, 而突变体spl1根际培养基的颜色没有明显变化, 表明spl1的低磷根际酸化反应能力降低。当低磷胁迫处理延长20天, spl1叶片的花青素积累明显高于野生型。同时也出现, 即使在磷营养正常条件下, spl1突变体也表现出根毛数量与长度增加的特征。进一步的研究表明, 在低磷条件下, spl1突变体根部的磷含量略高于野生型, 与磷转运相关基因的表达量明显高于野生型。分子遗传学分析结果表明, SPL1基因受低磷胁迫诱导, 主要在拟南芥的叶片和花等组织中表达, 其编码的蛋白广泛分布在细胞的各个部位。以上结果表明, SPL1参与介导低磷诱导的拟南芥根际酸化反应, 调节多种低磷胁迫反应及低磷条件下磷饥饿诱导基因的表达。     

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。     

拟南芥BAND7基因序列分析及相关突变体的生理功能研究

BAND7是具有SPFH特征结构域的一类膜蛋白,同其他膜蛋白偶联,调节离子转运和信号转导,广泛分布于不同的动物细胞中.通过序列比对,在模式植物拟南芥中鉴定到4个可能编码BAND7蛋白的基因,其基因代码分别是Atlg69840、At3g01290、At5g62740和At5g51570.半定量反转录PCR检测发现,它们在拟南芥的叶和根中都有表达,叶中的表达均高于根.通过PCR检测,获得基因Atlg69840和At5g51570的T-DNA插入敲除型纯合突变株SALK_088328和SALK_104547.通过对比野生型植株和基因敲除突变体在不同培养基上的根长和鲜重方面的差异,证明植物BAND7基因At5g51570参与了植物钙离子的吸收过程.     

拟南芥AtUNE12基因的耐盐功能初探

bHLH转录因子家族成员在植物生长发育、生理代谢及非生物胁迫响应过程中起重要作用。本研究选取拟南芥抗逆相关bHLH转录因子家族中AtUNE12基因为研究对象,对其进行耐盐功能初探。首先构建AtUNE12基因的植物过表达载体（pROKⅡ-AtUNE12）,通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,利用qRT-PCR技术检测获得T₃代AtUNE12过表达转基因植株。在盐胁迫下,分析过表达AtUNE12与野生型拟南芥长势、根长及鲜重;比较过表达AtUNE12与野生型植株的电解质渗透率、失水率、MDA含量、POD与SOD活性及H₂O₂含量,鉴定AtUNE12基因是否具有耐盐能力。结果表明：过表达AtUNE12基因降低了拟南芥植株的失水率、电解质渗透率及MDA含量,保护细胞膜结构的完整性;增强了POD与SOD活性,降低了拟南芥植株内的H₂O₂含量,进而增强拟南芥植株的ROS清除能力,从而提高拟南芥的耐盐能力。     

胶孢炭疽菌热休克蛋白基因Cghsp90的RNAi突变体获得与功能分析

为揭示胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)热休克蛋白基因Cghsp90在抗逆境胁迫中的功能,利用RNAi技术结合PEG介导的原生质体转化方法,获得了Cghsp90的RNAi突变体菌株,经实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对野生型菌株和突变体菌株间Cghsp90基因差异表达分析以及NaCl、H_2O_2、SDS、Congo Red、18℃(Cold)和33℃(Hot)等非生物胁迫条件下野生型菌株和突变体菌株的胁迫耐受性分析。通过特异性引物检测鉴定、qRT-PCR分析,获得Cghsp90的RNAi突变体pSilent-1:Cghsp90-1和pSilent-1:Cghsp90-2;与野生型菌株相比,侵染过程中Cghsp90基因的表达量显著低于野生型菌株,8个致病相关基因显著下调表达;突变体菌株的产孢量下降、分生孢子畸形、萌发率下降;在非生物胁迫条件下,突变体菌株较野生型菌株更为敏感;在胶孢炭疽菌的分生孢子中研究Cghsp90基因的形态建成与萌发,对应变逆境胁迫以及调控致病相关基因等方面发挥重要的作用。