慢病毒介导CDCA5敲低的三阴乳腺癌细胞的构建及鉴定

目的:利用RNA干扰技术与慢病毒感染体系构建稳定干涉细胞分裂周期相关蛋白5(CDCA5)基因的三阴乳腺癌细胞系,研究CDCA5在三阴乳腺癌细胞增殖过程中发挥的功能。方法:首先通过分子克隆技术构建稳定干涉CDCA5基因的慢病毒短发夹RNA(shRNA)质粒,并用PCR、琼脂糖凝胶电泳和深度测序技术进行验证;在此基础上,利用慢病毒感染体系将干涉质粒进行病毒包装、感染三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过SDS-PAGE、Western印迹检测MDA-MB-231细胞中CDCA5蛋白质的表达水平;通过细胞活力检测实验研究干涉CDCA5对三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。结果:琼脂糖凝胶电泳与DNA测序结果显示稳定干涉CDCA5载体构建成功;SDS-PAGE及Western印迹结果显示稳定干涉CDCA5质粒在MDA-MB-231中获得表达,并能够敲低CDCA5蛋白表达水平,稳定干涉CDCA5的三阴乳腺癌细胞系构建成功;细胞活力检测实验结果表明,与对照组相比,干涉CDCA5蛋白表达水平能有效抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力。结论:运用RNA干扰技术与慢病毒感染体系能够构建稳定干涉CDCA5的三阴乳腺癌细胞系,该细胞系的建立为进一步研究CDCA5在三阴乳腺癌发生、发展及转移过程中的作用及分子机制提供了重要的实验材料。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

FUT8基因RNAi慢病毒载体的构建及对MCF-7细胞增殖的影响

旨在构建FUT8基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并观察其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。针对FUT8基因设计3组短发夹RNA序列,退火合成双链DNA,通过连接线性化的p GC-LV-GFP载体,构建mi RNA慢病毒载体质粒,并将其转化至感受态细胞DH5α;测序验证正确后进行FUT8基因慢病毒载体的包装及病毒滴度测定,将获得的重组慢病毒p GC-sh FUT8转染MCF-7细胞,利用Real time-PCR、Western blot分别验证转染后MCF-7细胞中FUT8 m RNA及蛋白的表达,MTT法及克隆形成实验检测sh FUT8对MCF-7细胞增殖能力的影响。测序证实成功构建针对FUT8基因的RNAi慢病毒载体;慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒悬液滴度5×108 TU/m L;荧光显微镜下观察各转染组细胞GFP的表达,转染效率达90%以上;Real-time PCR、Western blot结果显示干扰组FUT8的m RNA及蛋白表达水平较对照组显著降低,其中p GC-sh FUT8-2序列对FUT8基因的干扰效率可达80%,干扰效果最佳,FUT8沉默后MCF-7细胞增殖能力下降。     

SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系。方法:根据人Gnb211 c DNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入p Lentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证。用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率。使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响。结果:酶切和测序证实RACK1sh RNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 sh RNA的慢病毒载体质粒。慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1sh RNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制。结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

串联亲和标签LOX蛋白慢病毒表达载体的构建及在乳腺癌细胞中的表达

目的:为了研究赖氨酰氧化酶(Lysyl Oxidase,LOX)及其相互作用蛋白质在乳腺癌中的功能,构建带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的重组LOX蛋白慢病毒表达载体并在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达。方法:设计引物通过聚合酶链式反应获得带StrepⅡ/FLAG串联亲和标签的LOX蛋白(LOX-SF)的亲本质粒,双酶切后鉴定测序克隆至GV303表达载体,连同慢病毒包装质粒共同转染293T得到GV303/LOX-SF慢病毒,将其转染MDA-MB-231细胞,使用荧光定量PCR和蛋白质印迹实验对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。结果:通过串联亲和纯化获得LOX-SF重组蛋白,使用标签抗体成功鉴定到LOX-SF重组蛋白在MDA-MB-231细胞内稳定表达。结论:GV303/LOX-SF的构建,使带StrepⅡ/FLAG融合标签的LOX蛋白在MDA-MB-231中成功表达及纯化,为筛选和研究LOX及其相互作用蛋白在乳腺癌细胞内的功能奠定了实验基础。     

SV40T抗原肝细胞特异性表达载体的构建与鉴定

目的构建在肝细胞中特异性表达SV40T抗原的表达载体并进行鉴定。方法通过Gateway技术构建SV40T慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T并通过菌落PCR筛选鉴定,将其与辅助质粒p LV-helper1、p LV-helpe2、p LV-helper3共转染293T细胞包装慢病毒并在荧光显微镜下进行滴度值测定。用SV40T慢病毒载体转染肝癌Hep G2细胞,并在荧光显微镜下行转染效率测定;实时荧光定量PCR检测转染细胞SV40T基因的表达水平。结果 Gateway技术构建的慢病毒载体p LV-Puro-ALBSV40T经鉴定完全正确;慢病毒包装48 h后视野下可见清晰绿色荧光表达,病毒滴度为1.73×108 TU/m L。慢病毒载体成功转染Hep G2细胞,转染效率约70%,并通过RT-PCR检测SV40T表达水平明显升高。     

慢病毒介导RNA干扰HPIP蛋白抑制肿瘤细胞增殖

目的:建立高效稳定的造血相关的PBX相互作用蛋白质(HPIP)小干扰RNA(siRNA)细胞导入方法,检测HPIP的表达对肿瘤细胞生长增殖的影响。方法:构建人HPIP慢病毒siRNA干扰载体,将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测Lenti-H1 HPIP siRNA的干扰效果;将Lenti-H1 HPIPsiRNA与4个包装质粒共同转染293T细胞,包装成慢病毒后,感染宫颈癌HeLa和肝癌HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,收集细胞进行Western印迹检测;用结晶紫实验检测其对肿瘤细胞生长增殖的影响。结果:构建的Lenti-H1 HPIP siRNA能有效抑制HPIP的表达;结晶紫实验显示,慢病毒介导的HPIP siRNA导致细胞增殖的显著抑制。结论:慢病毒介导的HPIP敲减能明显抑制肿瘤细胞的增殖,HPIP可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点。     

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制NLRP3表达的HepG2细胞的构建

目的:构建针对NLRP3基因的短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体,在Hep G2细胞中鉴定该载体对NLRP3的抑制效果。方法:设计针对NLRP3基因的sh RNA序列,将其插入慢病毒表达载体p WPT-U6-sh RNA-CMV-GFP中,将载体与包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转染293T细胞,进行病毒包装;得到的病毒原液浓缩后系列稀释为9个浓度递减的病毒液,分别转染293T细胞后进行滴度测定;用获得的慢病毒液感染人肝癌细胞系Hep G2,获得稳定沉默NLRP3的细胞株;利用实时定量PCR和Western印迹检测稳定细胞株中NLRP3的沉默效应。结果:构建了具有沉默效应的慢病毒干扰载体;稀释法测定干扰病毒滴度为2×108TU/m L;实时定量PCR和Western印迹实验均证实慢病毒转染后,细胞株中NLRP3表达水平明显降低。结论:构建了人NLRP3基因特异性慢病毒干扰载体,获得NLRP3基因稳定干扰的Hep G2细胞株。     

慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A 细胞Tmub1 基因沉默及稳定感染细胞 系的建立

目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。     

PRMT5调控三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性的研究

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)对三阴性乳腺癌对多西他赛敏感性的影响,为三阴性乳腺癌的治疗提供新的思路。方法:通过包装慢病毒构建PRMT5过表达稳转细胞系和PRMT5敲除细胞系。采用平板克隆测定不同浓度下多西他赛对于MDA-MB-231细胞和PRMT5过表达细胞增殖的影响。采用流式周期和凋亡检测不同浓度多西他赛对PRMT5过表达和PRMT5敲除以及MDA-MB-231亲本细胞的周期以及凋亡的影响。采用Western Blot方法检测PARP以及p21、p27及LC3等表达。结果:成功构建PRMT5过表达及敲除稳转系。与对应对照组(MDA-MB-231细胞)比较,4nM和8nM的多西他赛处理的PRMT5过表达细胞系(MDA-MB-231-PRMT5细胞)形成克隆率明显降低(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P0.05),细胞周期p21分子表达增多(P0.05),但未随浓度增加增高(P0.05),cycling D1、PARP剪切体、LC3-Ⅱ的表达均明显增加(P0.05)。4nM和8nM的多西他赛处理的PRMT5敲除稳转系(MDA-MB-231-sh PRMT5)细胞凋亡率、p21、p27、cyclin D1、LC3-Ⅱ的表达均较对应对照组(MDA-MB-231细胞)明显降低(P0.05),LC3-Ⅱ表达水平较亲本低(P0.05)。结论:PRMT5高表达可增加MDA-MB-231细胞对多西他赛的敏感性,PRMT5有望成为多西他赛临床治疗敏感性预测和方案选择的关键分子,并有望成为调控多西他赛等化疗药物耐药的新靶点。     

可诱导型敲低PICH的MDA-MB-231细胞系的构建及鉴定

目的:构建稳定表达可诱导型polo样激酶1相关检查点解旋酶(PICH)短发夹RNA(shRNA)的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231,并通过检测加入诱导剂后细胞的增殖评价敲低效果。方法:设计并合成2条特异靶向PICH的shRNA序列,用分子克隆技术构建pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin质粒,经菌落PCR及基因测序验证;慢病毒包装并感染细胞,通过抗性筛选获得嘌呤霉素抗性的细胞;经强力霉素(DOX)诱导表达后,Western印迹检测PICH的敲低效果,并通过MTT法对细胞增殖进行检测。结果:菌落PCR凝胶电泳及DNA测序结果显示pLKO.1-tet-on-shPICHPuromycin质粒构建成功;Western印迹结果表明,在DOX诱导下,MDA-MB-231细胞中的PICH蛋白质表达下降,表明可诱导型PICH稳定敲低细胞系构建成功;进一步实验结果显示,MDA-MB-231细胞的增殖随PICH的表达下调而受到显著抑制。结论:构建了可诱导稳定敲低PICH的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231,为进一步研究PICH在三阴乳腺癌中的作用以及具体的分子机制奠定了实验基础。     

细胞培养液pH对慢病毒包装及感染效率的影响

为解决实验室中包装慢病毒转染效率低、感染效率低的问题,从培养液p H角度对病毒包装及感染进行优化。首先构建慢病毒载体cop GFP质粒,采用磷酸钙法和Lipofectamine2000法,转染不同p H培养液培养的293T细胞。在荧光显微镜下比较转染效率,发现磷酸钙法p H(6.5~7.5)转染效率高,培养液p H(6~8)对Lipofectamine2000法转染几乎无影响。使用标准p H(7.2~7.4)培养液包装慢病毒,收取病毒上清液后调节至不同p H,加或不加Polybrene感染293T细胞,发现p H在8~9附近感染效率高,调节慢病毒p H至弱碱性与Polybrene同时使用有助于提高感染效率。     

人成纤维细胞生长因子受体2IIIc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。     

第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探

目的:对目前最为常用的三质粒慢病毒包装系统进行优化,以期明确各质粒表达的病毒成分对提高慢病毒包装效率的重要性。方法:在限定总质粒量为10μg的情况下,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的目的质粒、表达gag/pol、Rev、VSVG的包装质粒按不同比例混合,转染293T细胞进行病毒包装,48 h后收集上清用于感染293T及K562细胞,72 h后经流式细胞术检测GFP+阳性细胞比例,分析所获病毒的感染效率。结果:采用不同的质粒混合比例包装的病毒感染效率具有明显差异,其中携带GFP的目的质粒量影响作用最为显著,当目的质粒量从15%(1.5μg)增至35%(3.5μg)时,GFP+293T细胞比例从14.2%升至45.1%,增加了3.2倍。当固定目的质粒量为35%,同时分别将表达gag/pol或Rev的质粒量从15%提高到25%时,改变Rev组的GFP+阳性率提升最明显,为1.5倍;而改变VSVG质粒量在已测试的混合比例中作用不显著。包装病毒感染K562细胞的结果与293T细胞类似。结论:通过对比包装病毒的感染效率,优化了慢病毒包装的混合质粒条件,并成功地应用于感染白血病细胞系;首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高病毒的包装效率,为利用慢病毒表达体系研究多种基因在血液系统中的功能奠定了技术基础。     

慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A 基因在HepG2 细胞表达及对 细胞增殖性影响的研究

目的:建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法:制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(Hsp90αE47A/psin-GFP),包装质粒(ΔNRF)及包膜蛋白质粒(VSV-G)。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果:转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升(为对照组的1.05±0.15倍,P<0.05,t检验),有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。(1.051±0.03vs1.349±0.05,P<0.05,t检验)。结论:成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

MicroRNA-221/222对乳腺癌MDA-MB-231/DOX细胞阿霉素耐药性的影响

目的:探讨微小RNA-221/222(miR-221/222)对乳腺癌MDA-MB-231/阿霉素(DOX)细胞DOX耐药性的影响。方法:采用脂质体法转染miR-221/222抑制物(miR-221/222 inhibitor)至MDA-MB-231/DOX细胞内(Inhibitor组),同时设立空白对照组和转染无关序列的阴性对照组,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞株及MDA-MB-231/DOX细胞株的miR-221/222表达水平及转染效率;CCK-8法检测转染48 h后MDA-MB-231/DOX细胞对DOX药物敏感性的变化;流式细胞术(FCM)检测转染MDA-MB-231/DOX细胞的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹实验(WB)检测转染后MDA-MB-231/DOX细胞内促凋亡蛋白p53上调凋亡调控因子(PUMA),Bcl2蛋白修饰因子(BMF)以及细胞周期蛋白激酶抑制因子p27(p27Kip1)的表达情况。结果:MDA-MB-231/DOX细胞中的miR-221/222表达水平高于亲本MDA-MB-231细胞(P0.05);MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 96 h后,miR-221/222的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);与空白对照组相比,MDA-MB-231/DOX细胞转染miR-221/222 inhibitor 48h后,DOX继续处理48 h后,细胞的凋亡率明显升高,且细胞内的促凋亡蛋白PUMA,BMF以及p27Kip1的表达均增加(P0.05);DOX对inhibitor组耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)显著低于空白对照组细胞及阴性对照组(P0.05)。结论:miR-221/222能够增加MDA-MB-231/DOX细胞对DOX的耐药性,这可能与下调促凋亡蛋白的表达有关;降低miR-221/222水平可诱导MDA-MB-231/DOX凋亡,并且上调促凋亡蛋白的表达,从而部分逆转MDA-MB-231/DOX对DOX的耐药性。     

慢病毒GV115-AIF siRNA 重组表达系统的构建及鉴定

目的:构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。方法:根据目的基因AIF以及RNA干扰序列设计原则,利用设计软件设计了3个可能的AIF si RNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-AIF si RNA重组质粒,并采用聚合酶链反应技术(PCR技术)和基因测序技术对GV115-AIF si RNA重组质粒鉴定。利用GV115病毒包装辅助p Helper 1.0质粒和p Helper 2.0质粒进行病毒包装。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用逆转录定量PCR技术(RT-PCR技术)检测转染后对人胚肾293T细胞中AIF基因的敲减效率,筛选最高效的AIF si RNA基因序列。结果:GV115-AIF si RNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。3个可能的AIF si RNA序列中基因敲减效率最高的可达到88.3%。结论:成功构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。     

慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞表达及对细胞增殖性影响的研究

目的：建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法：制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（Hsp90αE47A/psin-GFP）,包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VSV-G）。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果：转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升（为对照组的1.05±0.15倍,P〈0.05,t检验）,有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。（1.051±0.03vs1.349±0.05,P〈0.05,t检验）。结论：成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

SGK3基因RNAi慢病毒载体的构建及其对乳腺癌MB-474细胞增殖和凋亡的影响

旨在构建SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MB-474增殖和凋亡的影响。构建靶向SGK3的shRNA序列慢病毒载体,将其转染至人乳腺癌MB-474细胞以沉默SGK3基因,Real-time PCR、Western bloting方法检测MB-474细胞SGK3 mRNA及蛋白表达,MTT法和流式细胞术检测SGK3基因沉默对MB-474细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。测序结果显示,成功构建4组SGK3基因RNAi慢病毒表达载体,经293T细胞包装,病毒滴度为(3-8)×108 TU/m L;将慢病毒转染MB-474细胞后,Real-time PCR、Western bloting结果显示,干扰组SGK3的表达水平较对照组均降低,且PGC-LV3-SGK3-1序列对其干扰效果最佳,SGK3基因沉默可抑制MB-474细胞增殖、促进凋亡,但其对细胞周期进程无明显影响。成功构建靶向SGK3基因的RNAi慢病毒载体,SGK3基因沉默可影响乳腺癌细胞增殖和凋亡等生物学行为。