对硝基苯酚降解菌Pseudomonas sp. PDS-7的降解特性及 其降解相关基因的克隆

[目的]本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌,研究其对PNP的降解特性;克隆其降解相关基因,并进行表达.[方法]本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离PNP降解菌株;采用形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA分析对菌株进行初步鉴定;通过摇瓶试验研究菌株降解特性;利用SEFA-PCR技术克隆降解相关基因,并亚克隆到表达载体pET29a中,构建重组表达质粒pETpnpC,再转入受体菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达;通过分光光度法测定表达产物的酶活力.[结果]分离到一株PNP降解菌PDS-7,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.);该菌株能够以PNP作为唯一碳源、氮源和能源生长,菌株对PNP的最高耐受浓度为80 mg/L,最适降解温度为30℃,偏碱性条件有利于菌株对PNP的降解;克隆了PNP降解过程中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC及马来酰醋酸还原酶基因pnpD(GenBank登陆号EU233791);将pnpC在E.coli BL21(DE3)菌株进行了诱导表达,表达产物对偏苯三酚和邻苯二酚均有邻位开环活性,比活力分别为0.45 U/mg protein和0.37 U/mg protein,表明偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC得到了活性表达.[结论]分离鉴定了一株PNP降解菌Pseudomonas sp.PDS-7,研究了该菌株的降解特性,克隆和表达了降解相关基因.     

苯酚降解菌F6的筛选鉴定及降解特性

本研究利用逐级驯化的方法,从广西某工厂的废水中分离得到一株能利用苯酚作为唯一碳源生长的高效苯酚降解菌F6。采用16S r DNA序列分析的方法,将菌株F6鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。F6菌株在8 h内几乎完全降解100 mg/L的苯酚,降解率达99.9%,该菌株的菌体生长与苯酚降解呈同步趋势,主要在对数生长期降解苯酚。F6最高耐受苯酚浓度为1 800 mg/L,在温度25~40℃,p H值6.0~9.0,盐度0~40 g/L范围内,F6菌株均能保持对苯酚良好的降解能力。菌株F6的降解底物具有广谱性,除了能够利用苯酚作为唯一碳源,还可以利用邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、连苯三酚、甲苯、氯苯等酚类化合物为其生长代谢提供碳源和能源。综上所述,菌株F6在应用于处理成分复杂、含酚浓度较高的废水中将具有很大的潜力。     

絮凝剂产生菌CM-HZX2菌株的分离、鉴定以及应用研究

从污水处理厂的活性污泥中分离出一株微生物絮凝剂产生菌CM-HZX2,通过形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株属于陶厄氏菌(Thauera sp.),16S rDNA在Gen Bank的登录号为KT894041。实验表明,菌株CM-HZX2培养以及产絮凝剂的最适条件为pH 8.0,温度30℃,转速为150 r/min。该菌株微生物絮凝剂适应用条件范围广泛,适宜投加量为2%,能耐受5%以下的盐度,适用于低温环境下的水处理。在河道水体净化处理小试应用中能有效去除河水的浊度和总磷,去除率分别达到71%和54%。     

石油污染土壤中苯酚降解菌ad049的鉴定及降解特性

以苯酚为唯一碳源,采用富集培养方法,从陕北靖边油田污染土壤中分离获得1株苯酚高效降解菌(ad049),对菌株进行形态观察、生理生化检验及16S rDNA序列分析,确定该菌株为红球菌(Rhodococcus)。采用摇瓶振荡培养方法,研究了接种量、pH值、温度和底物浓度对ad049生长量和苯酚降解率的影响,同时对该菌株脱氢酶和邻苯二酚双加氧酶活性进行了测定。结果表明,ad049具有较强的苯酚降解能力;在苯酚浓度1000 mg/L,温度35℃,pH值8,接种量5%的培养条件下,反应24 h后,苯酚降解率达99%以上,且整个降解过程符合零级动力学方程,速率常数k_0=41.51,相关系数R~2=0.96。通过邻苯二酚双加氧酶活性的测定,推测出该菌株降解苯酚的途径可能是以邻苯二酚1,2双加氧酶为主要途径进行邻位开环,辅以邻苯二酚2,3双加氧酶进行间位开环。     

洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因克隆及序列分析

克隆洋葱伯克霍尔德氏菌L68双加氧酶区基因并对其进行序列分析。采用邻苯二酚喷洒方法从洋葱伯克霍尔德氏菌L68的基因文库中筛选到了1株含有双加氧酶区基因的重组子,其重组质粒命名为pB2k。重组质粒pB2k含有8030bp的L68基因片断,经BLAST比对,该片断含有11个与已报道的ORF相近的ORF。在该片断的5’端,ORF1和ORF2分别编码两个转移酶基因,tomA1t、omA2t、omA3和tomA4编码酚羟化酶组份,tomA5编码氧化还原酶,phnT编码铁氧还蛋白,phnE编码邻苯二酚2,3-双加氧酶,ORF3编码未知功能蛋白,phnG编码部分2-羟粘糠酸半醛脱氢酶。     

波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究

从活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌,经形态特征、生理生化试验及16S rDNA鉴定,该菌株为波茨坦短芽孢杆菌。该菌能以苯酚为唯一碳源和能源,最佳降解条件为:温度30℃,初始pH7.0,摇床转速为160 r/min。苯酚降解试验表明,该菌可在72 h内将初始浓度为1 600 mg/L苯酚完全降解。随着苯酚浓度的增加,底物抑制作用增强。应用Haldane方程对菌株的生长过程进行动力学模拟,拟合曲线与试验测定值相关性良好,各参数分别为μmax(最大比增长率)0.334 h-1,Ks(半饱和常数)14.07 mg/L,Ki(抑制常数)196.89 mg/L,且该菌株苯酚降解动力学与其生长动力学表现出相似的趋势。代谢机制研究表明,苯酚可诱导该菌合成邻苯二酚1,2-加氧酶降解苯酚。     

一株苯酚降解菌的筛选及其降解特性的初步研究

苯酚是一种严重污染物,目前的化学降解方法存在众多弊端,生物处理方法越来越受到重视。从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离,得到一株能够利用并降解苯酚的菌株P2。该菌株能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长,经BIOLOG细菌自动鉴定系统及16SrDNA鉴定,该菌株为类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）。通过苯酚羟化酶特异性引物的设计,从该菌株扩增出苯酚羟化酶大亚基（LmPH）基因,该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽。苯酚降解实验证实,该菌能在30℃192h内完全降解500mg／L的苯酚,Cu^2＋严重抑制该菌株对苯酚的降解,但碱性环境有利于其对苯酚的降解。     

苯酚降解菌phen8的分离筛选及其16SrDNA序列分析

为筛选高效苯酚降解菌株 ,从炼油厂排污废水中分离筛选到 1株苯酚降解菌 phen8。利用PCR方法和琼脂糖凝胶电泳技术检测到 phen8菌中苯酚羟化酶基因片段的特异性条带 ,从基因水平上证实了 phen8菌的苯酚降解功能的遗传基础。应用PCR技术克隆到 16SrDNA片段 ,其核苷酸序列分析结果表明 ,该菌株的 16SrDNA全序列与斯氏假单胞菌DSM 5 0 2 2 7和DSM 5 0 2 38的同源性为 98% (在GenBank中的登记号为AF 2 8476 4)。初步确立了该菌在微生物系统发育学上的地位 ,暂定为假单胞菌 (Pseudomonassp .) phen8。     

苯酚降解工程菌Bacillus subtilis dqly-2的构建

目的:构建苯酚降解工程菌Bacillus Subtilis dqly-2.方法:选取2株苯酚降解菌,分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa zllf4和枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis BHf3-4,体外扩增Pseudomonas aeruginosa zllf4的邻苯二酚2,3双加氧酶基因(SYJ),并将此基因转入Bacillus Subtilis BHf3-4中,构建基因工程菌,并对野生菌和工程菌降解能力进行比较.结果:作用96h后,工程菌苯酚降解率为96.18％,显著高于野生菌的84.78％.结论:成功构建高效苯酚降解基因工程菌.     

一株菲降解细菌的分离鉴定及其特性

通过选择性富集培养,从沈抚灌区石油污染土壤中分离到1株菲降解细菌.试验证明该菌株能以菲为唯一碳源和能源生长.经形态学、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列比对分析,确定该菌株属于不动杆菌属,命名为Acinetobacter sp. L2. 系统发育进化分析发现,L2菌株与Acinetobacter sp. DG880［AY258108］亲源关系最近.L2菌株培养7 d后对菲的降解率达96.3%.邻苯二酚2,3-双加氧酶活力测定表明,L2菌株可能含有菲降解基因.     

三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

【目的】研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH为7.0-7.5时生长最优。在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stcE1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。     

两株高效苯酚降解菌的筛选、鉴定及生物强化-DTRO组合工艺初步验证

【目的】从煤化工废水中分离、筛选苯酚高效降解微生物,初步考察微生物与DTRO技术联用,构建含酚废水生物强化处理工艺的可行性。【方法】采用苯酚浓度梯度培养基对苯酚降解微生物进行分离和筛选;根据菌体形态电子显微镜观察、菌株生理生化特性考察和16S r RNA基因系统发育树构建,对菌株进行初步生物学鉴定;将筛选出的高效苯酚降解菌制备成相应的菌剂与碟管式反渗透(DTRO)技术组合形成"生物强化-DTRO"工艺,并试用于含酚废水的处理。【结果】共获得7株纯化细菌,其中Phe-03和Phe-05为高效苯酚降解菌;该2株菌均可以苯酚为唯一碳源生长。经鉴定Phe-03为壤霉菌属(Agromyces)菌株;Phe-05为棒杆菌属(Corynebacterium)菌株。到目前为止,壤霉菌属(Agromyces)菌株降解苯酚尚未见报道。在初始苯酚浓度达到1 300 mg/L条件下,Phe-03和Phe-05菌株44 h内对苯酚降解率均达到70%以上;76 h后苯酚降解率均超过90%。组合形成的"生物强化-DTRO"工艺不仅可以有效去除废水中的酚类化合物,而且还能减少反渗透膜污染,以及增加膜的通透性。【结论】研究表明微生物技术可与DTRO技术联用,构建含酚废水生物强化处理工艺,可为含酚废水处理技术研究提供一种选择思路。     

一株木质纤维素降解菌的筛选及其全基因组分析北大核心CSCD

【目的】筛选和鉴定有木质纤维素降解能力的1株细菌,测定其相关酶活力并进行全基因组分析,为构建木质纤维素降解工程菌提供依据。【方法】采用3种木质素类似物(天青-B;酚红;愈创木酚)的脱色/染色法,从腐木和被枝叶覆盖的土壤中分离和筛选出1株具有较强木质纤维素降解能力的细菌。通过16S r RNA基因和全基因组序列分析对该菌进行种属鉴定。使用紫外分光光度法测定其锰过氧化物酶(Mn P)、漆酶(Lac)、羧甲基纤维素酶(CMCase)以及滤纸酶(FPA)活力,了解该菌相关酶活力大小在一定时间内的变化趋势。使用Illumina Miseq和454 GS Junior测序平台获取该菌的全基因组序列,将其全基因组序列经过注释的基因蛋白质序列提交COG和KEGG数据库进行BLASTp比对分析,确定该菌潜在的重要酶类和代谢途径,并对部分注释基因进行定量RT-PCR验证。【结果】筛选得到1株优势菌株S12,该菌经鉴定后命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)。在液体CMC-Na培养基中发酵28 h,菌体生长达到稳定期,纤维素降解相关酶活力也在此时达到峰值。生物信息学分析结果表明,菌株S12具有木质素降解通路中重要酶类的编码基因,如过氧化物酶、Fe-Mn型超氧化物歧化酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶和原儿茶酸-3,4-双加氧酶等,这些基因在以碱性木质素为碳源的培养条件下表达量不同程度地高于以葡萄糖为碳源的培养条件。另外,菌株S12具备完整的纤维素降解和乙醇生成通路。【结论】本研究首次揭示了Raoultella ornithinolytica S12具备有效的木质纤维素降解性能,这对于推动木质纤维素应用产业的发展具有重要意义。     

一株苯胺降解菌的分离及其苯胺降解特性的研究

目的:筛选高效苯胺降解菌并研究其降解特性,为利用微生物进行苯胺环境污染物修复奠定基础.方法:利用含苯胺的A15培养基分离筛选苯胺降解菌,探讨苯胺降解最佳条件、降解代谢途径,利用16S rDNA基因扩增测序法对株菌进行分子鉴定.结果:获得了一株以苯胺为惟一碳源、氮源生长的高效苯胺降解菌AN6-4.该菌降解苯胺的最高浓度为2500mg/L,降解苯胺的最适温度和pH值分别为30℃、7.0;该菌在60h内可以将1500mg/L浓度的苯胺完全降解;重金属离子对该菌株降解苯胺有不同程度的抑制作用;代谢机制研究表明,该菌株可以诱导合成邻苯二酚-2,3-双加氧酶并分泌到胞外降解苯胺;16S rDNA基因序列同源性比较结果表明该菌属芽孢杆菌的一种.结论:所获得的苯胺降解菌对于研究苯胺降解机制和苯胺环境污染物的生物修复具有重要的理论和潜在应用价值.     

海洋石油降解菌的筛选及复合菌系的构建

为采用生物法治理海洋石油污染,以原油为唯一碳源,从深圳海域5个采样点取样,通过富集、涂布平板分离高效石油降解菌,并以复配、正交等方式构建石油降解复合菌系;通过生理生化实验和16S r RNA基因序列分析对菌株进行鉴定;采用单因素实验对复合菌系降解石油的条件进行优化,并使用气相色谱-质谱法(GC-MS)研究其对石油的降解特性。结果显示,共分离得到22株高效石油降解菌,对石油的降解率为34.5%-52.2%;由S1-30、S1-38和S2-13构建了复合菌系SQ1,对石油降解率可达68.3%,3株菌分别鉴定为棒杆菌(Corynebacterium sp.)、迪茨氏菌(Dietzia sp.)和拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.);经优化,SQ1在最适条件下(30℃、p H7.6、石油浓度20 g/L),11 d内对石油的去除率高达73.5%;GC-MS结果表明,复合菌系SQ1对石油总烷烃的去除率为91.7%,对较难降解的C21-C35烷烃组分的降解率接近100%。研究表明,复合菌系SQ1在海洋石油污染的生物修复中具有较强的应用潜力。     

高效石油烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter sp.BZ-15)的筛选、鉴定及其降解性能研究

本研究旨在从土壤中筛选高效石油烃降解菌株,并对其系统分类和降解特性进行研究,为石油污染的原位修复奠定基础.该研究从滨州油井溢油污染土壤样品中分离得到一株高效石油烃降解菌株BZ-15,对菌株BZ-15进行形态观察、16S r RNA基因序列分析及系统发育树分析;对该菌株的生长特性进行研究;通过GC-MS分析其对原油组分中不同碳原子饱和烃的降解特性;同时研究吐温-20对其生长及降解特性的影响;对该菌株中的烷烃羟化酶基因alk M进行了克隆.结果表明,菌株BZ-15为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)细菌,在LB培养基中其代时为3.25 h,添加吐温-20代时为2.67 h,吐温-20可促进菌株BZ-15生长;该菌株可降解C13~C28碳链长度饱和烃,饱和烃降解率为61.0%,添加吐温-20饱和烃降解效率为52.2%,吐温-20可抑制菌株BZ-15降解饱和烃;菌株BZ-15存在烷烃羟化酶基因alk M,通过末端氧化途径对饱和烃进行降解.     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

一株降解对氯硝基苯的Comamonas sp. CNB1的分离鉴定及其降解特性

从处理某化工厂污水的活性污泥中分离到一株降解对氯硝基苯的细菌CNB1菌株。经过对其形态特征、生理生化、以及16S rDNA序列分析,该菌株初步鉴定为Comamonas sp.,进一步研究表明,该菌株能够以对氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长。生长过程中,氯离子释放同步于对氯硝基苯降解,且氯离子的释放量与对氯硝基苯的降解量相当。该细菌利用对氯硝基苯生长的最适生长温度和pH分别为28℃和9.0。测定了降解途径中相关酶的活性,表明初始降解过程是由对氯硝基苯还原酶催化的硝基还原反应,芳环的裂解是由2_氨基苯酚1, 6双加氧酶催化。     

一株降解对氯硝基苯的Comamonas sp.CNB1的分离鉴定及其降解特性

从处理某化工厂污水的活性污泥中分离到一株降解对氯硝基苯的细菌CNB1菌株。经过对其形态特征、生理生化、以及16S rDNA序列分析,该菌株初步鉴定为Comamonas sp.,进一步研究表明,该菌株能够以对氯硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长。生长过程中,氯离子释放同步于对氯硝基苯降解,且氯离子的释放量与对氯硝基苯的降解量相当。该细菌利用对氯硝基苯生长的最适生长温度和pH分别为28℃和9.0。测定了降解途径中相关酶的活性,表明初始降解过程是由对氯硝基苯还原酶催化的硝基还原反应,芳环的裂解是由2-氨基苯酚1,6-双加氧酶催化。     

不同条件下两株溶磷菌溶磷量及葡萄糖脱氢酶基因表达与酶活分析北大核心CSCD

【目的】获得大豆根际土壤中溶磷能力较强的菌株,明确在菌株溶磷过程中葡萄糖脱氢酶(GDH)的作用特点及其基因的表达水平。【方法】利用溶磷圈方法分离与纯化溶磷菌株,采用Vitek 2系统和16S r RNA序列分析菌株的分类地位;测定2菌株的溶磷量、GDH活性,并根据GDH基因的保守区序列设计引物,克隆GDH基因,利用实时荧光定量PCR测定不同条件下基因的相对表达量。【结果】筛选出2株具有较强溶磷能力的溶磷菌,分别鉴定为Pseudomonas sp.和Enterobacter sp.,2菌株最高溶磷量分别为558μg/m L和478μg/m L;成功地克隆了2株溶磷菌的GDH基因,片段大小分别为2007 bp和2066 bp;2菌株在不同磷源、不同p H值培养基中GDH活性及基因表达量不同,菌株wj1在高磷条件下基因表达量最高,磷胁迫条件下基因表达量较低,而wj3在不同磷源条件下GDH基因表达量都较低。且GDH基因表达量及酶活的变化与wj3菌株溶磷量没有直接的关系。【结论】从大豆根际土壤中分离获得溶磷能力较强的菌株Pseudomonas sp.wj1和Enterobacter sp.Wj3,GDH活性及基因表达在2株菌溶磷过程中具有不同的作用特点,2菌株溶磷机制不完全相同。