miR-146a抑制酪氨酸酶基因家族在小鼠黑色素细胞中表达

miRNA是在许多生物过程中都起着至关重要作用的一类内源性非编码的小RNA,与癌症、肿瘤的发生有关。现发现很多miRNA在黑色素生成中都有重要的调控作用,但miR-146a是否对黑色素的生成具有影响未见报道。本研究发现miR-146a通过靶向抑制酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)的表达而使黑色素生成降低。在小鼠黑色素细胞中分别转染miR-146a mimic和miR-146a 抑制剂,通过qRT-PCR与Western印迹分析比较各实验组中TYRP1基因与酪氨酸家族相关基因酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2, TYRP2)的表达差异。双荧光报告实验验证TYRP1与miR-146a的靶向关系,双荧光酶活性结果显示,实验组相比对照组,荧光素酶活性明显降低,说明TYRP1是miR-146a的靶基因之一;qRT-PCR和Western印迹结果显示实验组TYR、TYRP1及TYRP2 在mRNA水平和蛋白质水平表达均显著降低;紫外分光光度法检测黑色素含量,结果显示miR-146a mimic转染组黑色素含量明显下降,而抑制组的黑色素含量呈上升趋势。综上所述,miR-146a通过靶向抑制TYRP1基因的表达,而影响TYR家族成员的表达,调控黑色素的生物合成。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2（keratin2, Krt2）的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2 基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN 软件比对分析发现,羊驼Krt2 编码序列（cDNA）与NCBI公布的人KRT2高度同源（91%）;将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western 印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸相关蛋白-1（Tyrp1）、小眼畸形相关转录因子（Mitf）基因表达明显上调（P <0.05）;尤其在添加10 ng/mL KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍（P<0.01）,蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍（P<0.01）。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍（P <0.05）、1.8倍（P <0.01）和1.5倍（P <0.05）。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

FLT4 调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

血管内皮素生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3/FLT4）与黑色素瘤细胞的生长有关,其可能对毛色及黑色素生成有一定的调控作用。为探讨FLT4基因对羊驼毛色及黑色素生成的影响,本文采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western印迹对FLT4在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的表达进行了研究。结果显示,FLT4在不同毛色毛囊中外根鞘及毛乳头阳性表达不同,且棕色皮肤比白色皮肤阳性信号强;FLT4 mRNA在棕色羊驼皮肤的表达量明显高于白色羊驼皮肤 (P<0.01);FLT4蛋白在棕色皮肤中的表达量明显高于白色皮肤(P<0.01);为进一步研究FLT4对黑色素生成的影响;通过对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度的FLT4蛋白（0, 1, 10, 50, 100 ng/mL）,与对照组相比,添加FLT4蛋白后酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TYRP1)、受体酪氨酸激酶 c-KIT、小眼畸形相关转录因子(MITF)的 mRNA和蛋白质表达明显增加, 10 ng/mL组表达量最高(P<0.01);黑色素含量测定结果表明,不同浓度的FLT4蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素含量比对照组明显升高,添加FLT4蛋白10 ng/mL表达量最高(P<0.01)。由此可知,FLT4可以通过调节毛色相关基因的表达进而引起黑色素细胞中黑色素含量的变化。     

miR-146a抑制酪氨酸酶基因家族在小鼠黑色素细胞中表达北大核心CSCD

miRNA是在许多生物过程中都起着至关重要作用的一类内源性非编码的小RNA,与癌症、肿瘤的发生有关。现发现很多miRNA在黑色素生成中都有重要的调控作用,但miR-146a是否对黑色素的生成具有影响未见报道。本研究发现miR-146a通过靶向抑制酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)的表达而使黑色素生成降低。在小鼠黑色素细胞中分别转染miR-146a mimic和miR-146a抑制剂,通过qRT-PCR与Western印迹分析比较各实验组中TYRP1基因与酪氨酸家族相关基因酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase related protein 2,TYRP2)的表达差异。双荧光报告实验验证TYRP1与miR-146a的靶向关系,双荧光酶活性结果显示,实验组相比对照组,荧光素酶活性明显降低,说明TYRP1是miR-146a的靶基因之一;qRT-PCR和Western印迹结果显示实验组TYR、TYRP1及TYRP2在mRNA水平和蛋白质水平表达均显著降低;紫外分光光度法检测黑色素含量,结果显示miR-146a mimic转染组黑色素含量明显下降,而抑制组的黑色素含量呈上升趋势。综上所述,miR-146a通过靶向抑制TYRP1基因的表达,而影响TYR家族成员的表达,调控黑色素的生物合成。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成北大核心CSCD

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2(keratin2,Krt2)的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN软件比对分析发现,羊驼Krt2编码序列(c DNA)与NCBI公布的人KRT2高度同源(91%);将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/m L、10 ng/m L和100 ng/m L人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸相关蛋白-1(Tyrp1)、小眼畸形相关转录因子(Mitf)基因表达明显上调(P<0.05);尤其在添加10 ng/m L KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍(P<0.01),蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍(P<0.01)。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/m L、10 ng/m L和100 ng/m L人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍(P<0.05)、1.8倍(P<0.01)和1.5倍(P<0.05)。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

草鱼钠磷协同转运载体Slc34a2基因的克隆及组织表达分析

为了揭示草鱼对磷的吸收机制,运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端方法,从草鱼（Ctenopharyngodon idella）肠中克隆获得钠磷协同转运载体基因Slc34a2,该基因全长为2446 bp,包含了1938 bp的开放阅读框,47 bp的5非编码区（Untranslated region,UTR）和461 bp的3UTR,编码645个氨基酸。草鱼SLC34A2蛋白的分子式为C3215H5125N801O902S30,分子量大小为70.39 kD,等电点为5.68,总平均疏水指数为0.458。对草鱼SLC34A2蛋白结构和功能预测分析,发现SLC34A2蛋白有11个跨膜域,1个半胱氨酸富集区,且N-端在胞外而C-端在胞内,也在第二个细胞外环中发现4个N-糖基化位点。用邻接法构建系统进化树,发现草鱼Slc34a2基因与硬骨鱼类聚类为一支,且草鱼SLC34A2蛋白与鲤（Cyprinus carpio）和斑马鱼（Danio rerio）SLC34A2的相似性最高,分别为90.3%和87.0%。实验采用了实时荧光定量PCR对草鱼Slc34a2 mRNA进行组织表达分析,结果表明Slc34a2 mRNA在组织中广谱表达,且在肠中表达最高,其次是肝脏、鳃、肾脏、脾脏、皮肤、肌肉、脑和头肾。实验为以后研究提高鱼对磷的利用和减少磷的排放奠定分子基础。     

DKK3调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

Dickkopf-3(DKK3),Wnt/p-catenin信号通路中一个重要的抑制因子,可能参与调控黑色素生成过程.本文研究了DKK3在羊驼黑色素细胞中黑色素生成的作用.在羊驼黑色素细胞中,过表达DKK3显著下调Wntl,Lefl,Myc和黑色素生成相关基因MITF及其下游基因TYR,TYRP1和TYRP2的表达,在...     

MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA 和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p 对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4, CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降（34.78 ± 16.09）%(P<0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3′ untranslated region (3′-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著（53.66 ± 2.11）%（P<0.01）。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为（70.26 ± 4.84）%（P<0.01）和（70.11 ±9.05）%（P<0.01）。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素（eumelanin,EM）和褐黑素（phenomelanin,PM）显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。     

MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA 和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p 对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4, CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降（34.78 ± 16.09）%(P<0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3′ untranslated region (3′-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著（53.66 ± 2.11）%（P<0.01）。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为（70.26 ± 4.84）%（P<0.01）和（70.11 ±9.05）%（P<0.01）。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素（eumelanin,EM）和褐黑素（phenomelanin,PM）显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。     

Slc45a2 and V‐ATPase are regulators of melanosomal pH homeostasis in zebrafish,providing a mechanism for human pigment evolution and disease

We present here the positional cloning of the Danio rerio albino mutant and show that the affected gene encodes Slc45a2. The human orthologous gene has previously been shown to be involved in human skin color variation, and mutations therein have been implicated in the disease OCA4. Through ultrastructural analysis of the melanosomes in albino alleles as well as the tyrosinase‐deficient mutant sandy, we add new insights into the role of Slc45a2 in the production of melanin. To gain further understanding of the role of Slc45a2 and its possible interactions with other proteins involved in melanization, we further analyzed the role of the V‐ATPase as a melanosomal acidifier. We show that it is possible to rescue the melanization potential of the albino melanosomes through genetic and chemical inhibition of V‐ATPase, thereby increasing internal melanosome pH.     

鸡Slc24a5基因的cDNA克隆、表达分析及其与黑色素沉积的关系研究

黑色素是一种由醌/吲哚-醌来源的混合物组成的生物高分子化合物.目前在小鼠中已发现的和黑色素沉积相关的基因已经超过了100个.Slc24a5(solute carrier family 24,member 5)基因是在斑马鱼中克隆的一个新基因.研究表明,Slc24a5基因可以调控斑马鱼中的黑色素沉积.鸡作为一种模式动物,已经广泛地被应用于实验研究.为了研究Slc24a5基因在鸡中的情况,克隆了鸡Slc24a5基因全长CDS,并且分析了其与黑色素沉积的关系.鸡Slc24a5基因全长CDS为1 269 bp,编码一个423氨基酸残基的蛋白质.该蛋白质比哺乳动物中的少大约80个氨基酸残基.基因全长超过11 kb,包含8个内含子和9个外显子.RT-PCR结果显示,鸡Slc24a5基因在多处组织表达(眼、脑、皮、肉、心、肝、肾和肺).通过荧光实时定量PCR对不同鸡种中的Slc24a5基因表达量进行检测,发现其在白莱杭,乌骨鸡和北京油鸡的眼睛中表达量很高.并且在乌骨鸡的皮肤和肌肉中Slc24a5基因也有很高的表达.乌骨鸡眼睛中的Slc24a5基因表达量为白莱杭的2倍.而在乌骨鸡皮肤中,Slc24a5基因表达量为白莱杭的70倍,为北京油鸡的15倍.Slc24a5基因在乌骨鸡肌肉中的表达量为白莱杭的15倍,为北京油鸡的3倍.同时通过对这3个鸡种中黑色素在各组织中沉积量进行分析,发现黑色素沉积越多的地方,Slc24a5基因表达量越高.这些结果表明鸡Slc24a5基因的表达与鸡中黑色素的沉积相关.     

内皮素-2促进体外培养的绵羊皮肤黑色素细胞增殖及黑色素生成

内皮素（endothelin,ET）及其受体在黑色素细胞成熟分化时起着有效的促进作用.然而,内皮素-2（ET-2）在黑色素生成的作用方面,还处于争论中或报道不一致.在此,我们研究ET-2对体外培养的绵羊皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响.比较实验组ET-2（1,10,100 nmol/L）与空白对照组,通过MTT法和Ando等的方法检测出黑色素细胞的增殖率和黑色素含量显著增加.荧光定量PCR和Western 印迹分别检测出内皮素受体B(Bdnrb);酪氨酸激酶受体(Kit);酪氨酸酶(Tyr);酪氨酸相关蛋白-1(Tyrp-1)基因的mRNA水平及蛋白水平的相对表达量显著增加.这些数据表明,ET-2可能促进绵羊的皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成.     

Slc25a17 acts as a peroxisomal coenzyme A transporter and regulates multiorgan development in zebrafish

Slc25a17 is known as a peroxisomal solute carrier, but the in vivo role of the protein has not been demonstrated. We found that the zebrafish genome contains two slc25a17 genes that function redundantly, but additively. Notably, peroxisome function in slc25a17 knockdown embryos is severely compromised, resulting in an altered lipid composition. Along the defects found in peroxisome-associated phenotypic presentations, we highlighted that development of the swim bladder is also highly dependent on Slc25a17 function. As Slc25a17 showed substrate specificity towards coenzyme A (CoA), injecting CoA, but not NAD⁺, rescued the defective swim bladder induced by slc25a17 knockdown. These results indicated that Slc25a17 acts as a CoA transporter, involved in the maintenance of functional peroxisomes that are essential for the development of multiple organs during zebrafish embryogenesis. Given high homology in protein sequences, the role of zebrafish Slc25a17 may also be applicable to the mammalian system.     

Hsa_circ_0087354通过hsa-miR-199-3p/SLC7A11调节MG-63细胞增殖及氧化还原状态

环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类新型非编码RNA。已有研究表明,其在细胞氧化还原反应中发挥重要作用。在本文前期研究中,发现通过real-time PCR检测,hsa_circ_0087354与细胞的氧化还原状态密切相关。过表达hsa_circ_0087354后,活性氧1(reactive oxygen species1,ROS1)基因表达显著下降(P＜0.01),超氧化物歧化酶1(surperoxide dismutase1,SOD1)表达显著升高(P＜0.05);细胞内SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)活性以及谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度显著升高(P＜0.01),细胞增殖能力增强(P＜0.05)。生物信息学分析预测,hsa-miR-199-3p与hsa_circ_0087354和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)存在结合位点,可能存在靶向调控关系。双荧光素酶报告基因结果证实了hsa-miR-199-3p与hsa_circ_0087354和SLC7A11之间的靶向调控关系。构建过表达hsa_circ_0087354质粒和ctrl质粒,合成hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199b-3p 和hsa-miR-NC mimics。通过Real-time PCR分析发现,转染hsa_circ_0087354后,hsa-miR-199-3p表达显著降低(P＜0.01),SLC7A11表达显著升高(P＜0.05)。转染hsa-miR-199-3p后,SLC7A11基因表达显著下降(P＜0.001),细胞内SOD和GPx活性以及GSH浓度显著降低(P＜0.01),细胞增殖能力下降(P＜0.05)。研究结果表明,hsa_circ_0087354通过吸附hsa-miR-199-3p,增强SLC7A11表达,促进氧化应激MG-63细胞增殖,降低氧化应激水平。