斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达

[目的]合成密码子优化的斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因(LN),构建真核重组表达载体p PICZαA-LN,实现LN在毕赤酵母中的重组DNA表达并对其纯化。[方法]参考编码斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin成熟肽的c DNA序列,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性,优化合成LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因LN,两者之间通过α因子信号肽酶切位点对应的核苷酸序列连接;选择表达载体p PICZαA,构建重组表达载体p PICZαA-LN;电转化至毕赤酵母X-33,29℃、p H 6.0条件下,采用1.0%甲醇诱导表达目的蛋白;采用阳离子交换层析对表达产物进行分离纯化。[结果]Tricine-SDS-PAGE分析显示,培养72 h的表达产物经阳离子交换层析,获得了重组体LEAP-2成熟肽、NK-lysin成熟肽和两者的串连表达物;LEAP-2成熟肽的分泌表达效率较NK-lysin成熟肽的高。[结论]实验构建了斑点叉尾鮰LEAP-2与NK-lysin串联基因的真核重组表达载体,并在毕赤酵母X-33中成功表达。     

基于重组毕赤酵母的斑点叉尾鮰β-防御素表达

β-防御素是斑点叉尾鮰Ietalurus punetaus抵御病原微生物侵染的首要蛋白质免疫因子,其一级结构包含氨基端24个氨基酸组成的信号肽和羧基端43个氨基酸组成的成熟肽,该成熟肽赋予β-防御素的生物学活性。文中首次构建了产斑点叉尾鮰β-防御素的毕赤酵母Pichiapastoris重组菌株,实现了基于真核表达的斑点叉尾鮰β-防御素的生物合成。首先通过RT-PCR从斑点叉尾鮰皮肤中分离β-防御素成熟肽基因"IPBD",将其与表达载体p PICZαA连接并转入毕赤酵母X-33后,获得重组毕赤酵母菌株;经含1 000μg/m L博来霉素的培养基筛选,获得高拷贝重组菌株。以BMM培养基(无氨基氮源培养基)替代BMMY培养基(含氨基氮源培养基),对重组菌株的发酵培养条件进行优化,确定其产斑点叉尾鮰β-防御素的最适条件为:28℃、250 r/min、1.0%甲醇诱导表达96 h。重组菌株产物经镍离子亲和层析获得分子量为5.98k Da的纯化蛋白,基于MALDI-TOF-TOF的质谱分析证明该纯化蛋白为重组IPBD。抑菌活性测定结果表明重组IPBD对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单增李斯特菌Listeria monocytogenes以及革兰氏阴性的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的抑菌率分别为69.6%、71.6%和65.8%。本研究为鱼类来源天然小分子抗菌肽的开发提供了可参考的重组DNA技术。     

基于SOE-PCR的两种鱼类hepcidin基因串联及其在毕赤酵母中的表达

Hepcidin抗菌肽是由生物肝脏细胞表达的一类具有抗菌作用和铁代谢调节功能的碱性小分子肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。通过重组DNA表达技术制备抗菌肽无疑是一条良好的途径。为扩大hepcidin的抗菌谱和提高其表达量,通过SOE-PCR将斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus hepcidin成熟肽的c DNA"m CH"与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus hepcidin成熟肽的c DNA"m TH"进行串联,并在两端分别添加Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,以p PIC9K为真核表达载体,成功构建了"p PIC9K-m CH-m TH"重组表达载体;电转化进毕赤酵母GS115中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选以及对酵母基因组DNA的PCR鉴定,得到高拷贝酵母转化子;在30℃、以1%的甲醇诱导表达不同时间后,经Tricine-SDS-PAGE分析,表明发酵培养72 h时目的蛋白的表达量最高,达77 mg/L。发酵上清经SP-Sepharose阳离子交换层析纯化后获得高纯度的目的蛋白。抑菌实验显示含目的蛋白的发酵上清和经纯化后的重组目的蛋白对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有良好的抑菌效果。本研究结果为hepcidin抗菌肽的产业化生产奠定了良好的基础。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。       

蜡样芽孢杆菌胶原酶基因colR75E在毕赤酵母中的重组表达

【目的】利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶。【方法】以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶col R75E基因,构建p PICZαA/col R75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化。将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组Col R75E胶原酶。利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、I型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶Col R75E的活性及底物特异性进行分析。【结果】毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶Col R75E的条件为p H 6.0,甲醇终浓度为2.5%,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及I型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95%,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg。该酶对I型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性。【结论】利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶Col R75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础。     

斑点叉尾鮰NK-lysin基因的cDNA克隆及融合表达质粒构建

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)NK-lysin-type1的成熟肽为研究目标,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰的鳃中克隆到编码NK-lysin成熟肽的基因,该基因编码由92个氨基酸残基组成的成熟肽;6个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽内,它们被推测与NK-lysin的抗菌活性有关。为了进一步构建原核表达系统用于成熟肽的表达,pET-32a(+)被选择作为融合表达质粒,该质粒含有1个trxA融合头基因,与目的片段mNK-lysin连接后形成融合基因trxA-mNK-lysin,进而有助于在工程菌E.coliBL21(DE3)中的可溶性融合表达。通过PCR、EcoR I和HindⅢ双酶切处理以及DNA测序鉴定,证明pET-32a-mNK-lysin重组融合表达质粒已经被成功构建;将其转化至工程菌E.coliBL21(DE3)后的测序结果表明该重组质粒未发生任何DNA变异。     

三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的表达

Crustin主要分布于甲壳动物中,是一种富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,在甲壳动物的先天免疫系统中发挥重要作用。根据crustin的一级结构特征可以将其分为不同的类型,本文以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的PtCrustin2成熟肽为研究对象,通过构建毕赤酵母表达系统,以期实现PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达。首先,从其鳃中提取总RNA,通过RT-PCR得到编码PtCrustin2成熟肽的cDNA(m Pt Crustin2),并在其5'和3'端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶位点;然后将此片段与表达载体p PIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-m Pt Crustin2;电转入毕赤酵母GS115细胞后,以不同浓度的G418筛选到高拷贝酵母转化子,经0.5%甲醇诱导表达和固化金属离子亲和层析(IMAC)分离,获得了纯化的重组体mPt Crustin2,Tricine-SDS-PAGE分析显示其分子量约10.5 k Da;抑菌实验证明重组体mPtCrustin2对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有一定的抑菌效果。本研究首次实现了三疣梭子蟹Pt Crustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为进一步研究提供参考。     

重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究

为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率,首先合成了胰岛素原基因,并在其序列的N端引入了一段引导肽,构建成p PICZα-A-Pro-INS重组分泌型表达载体。将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母GSll5感受态细胞,筛选获得分泌型高表达工程菌株,重组蛋白的表达水平为300 mg/L,占分泌总蛋白的40%左右。该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表达胰岛素的基因至关重要。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究

Mytimacin是主要在无脊椎动物中表达的Macin抗菌肽家族中的一员,具有较强的抗病原微生物活性,是利用重组DNA技术开发天然抗菌剂的良好候选者。通过RT-PCR从青蛤(Cyclina sinensis)闭壳肌中克隆编码Mytimacin成熟肽的基因,经3次PCR在该基因的5’端添加Xho I限制性酶切位点和信号肽酶识别位点、3’端添加Xba I限制性酶切位点和6×His,获得目的基因"CsMm";以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm。通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,在28℃、250 r/min条件下,使用1.5%的甲醇诱导表达72 h;使用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,并通过MALDI-TOF-TOF质谱分析对纯化产物进行鉴定。另外,通过涂布法和浊度法考察重组CsMm的抑菌活性。结果表明:基于X-33/pPICZαA-CsMm重组毕赤酵母的外源表达获得了表达量为25.6 mg/L的重组蛋白,经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定其为分子量约7.8 kD的预期重组CsMm。抑菌试验证明重组CsMm对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)具有明显的抑菌活性。构建的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm能有效合成具有生物学活性的重组青蛤Mytimacin,旨为贝类来源天然小分子抗菌剂的开发提供可资参考的技术途径。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

T4溶菌酶在多型汉逊酵母中的表达及抑菌活性测定

溶菌酶是一类对多种细菌都具有明显杀菌效果的蛋白质.本研究将T4溶菌酶基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,以汉逊酵母A16来源的rDNA序列作为同源重组序列,在毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（pGAP）的调控下,使T4溶菌酶在汉逊酵母A16中以组成型方式稳定高效表达.在37℃,pH6.0,摇瓶发酵培养72h后,表达量达到0.49g/L.结果表明,汉逊酵母能够识别源自毕赤酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和醇氧化酶终止子序列,而且rDNA作为同源重组序列可以产生多拷贝的汉逊酵母重组子.对重组蛋白进行了N端测序、质谱及SDS-PAGE检测,发现重组蛋白N端与T4溶菌酶N端氨基酸序列一致,分子量大小约为18.7kD,与预计分子量大小相符.重组T4溶菌酶对革兰氏阳性和阴性细菌都具有抑菌活性和溶壁活性.非变性SDS-PAGE（无DTT）检测发现,重组T4溶菌酶形成了分子内二硫键和少量分子间二硫键,这种不正确的二硫键可能导致重组T4溶菌酶损失部分抗菌活性.     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

脊髓灰质炎2型病毒样颗粒在毕赤酵母内的表达与鉴定

目的构建可稳定表达脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)的整合型重组毕赤酵母,鉴定PV VLPs在毕赤酵母细胞中的表达及组装情况。方法根据毕赤酵母密码子偏好性优化salk株II型P1和3CD基因并连接到p Pic ZA载体,构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体;用Bgl II线性化p Pic ZA-P1-3CD载体,电转至毕赤酵母GS115中。通过Zeocin抗性筛选获得整合型重组毕赤酵母,随后用高浓度Zeocin抗性筛选得到高表达菌株。甲醇诱导后,用Western Blot检测目的蛋白表达;蔗糖密度梯度离心纯化PV VLPs并进行透射电镜观察。结果成功构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体,获得PV VLPs重组毕赤酵母。Western Blot在重组毕赤酵母裂解上清中检测到目的蛋白的表达;蔗糖密度梯度离心纯化后,在透射电镜中观察到直径为30 nm左右的VLPs,其形态与天然的PV颗粒相似。结论成功构建PV-2型VLPs的整合型重组酵母系统,并在毕赤酵母中组装形成了VLPs,为酵母表达系统中PV VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut+表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体

从毕赤酵母表达载体pPICZαA出发,构建了可直接克隆PCR产物的毕赤酵母分泌型表达载体（毕赤酵母表达型T载体）。设计合适的引物扩增一DNA片段,使该片断的上游含XhoⅠ和Eam1105Ⅰ酶切位点,下游含Eam1105Ⅰ和XbaⅠ酶切位点。通过XhoⅠ和XbaⅠ位点将扩增产物与质粒pPICZαA连接形成重组质粒。用Eam1105Ⅰ酶切重组质粒,回收大片段即得到毕赤酵母表达型T载体pPICZαT。使用该表达型T载体进行了里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因（cbh2）的克隆和在巴氏毕赤酵母中的表达。结果表明,使用表达型T载体可以直接克隆PCR产物,而且可以使外源基因在毕赤酵母中成功表达。另一方面,使用该载体时不需要使用限制性内切酶,从而可以避免在所表达蛋白的N-末端引入多余的氨基酸。     

三疣梭子蟹C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物。通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella lignieres)的活性。     

抗病毒蛋白RC28在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及活性比较

RC28蛋白是从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的新型抗病毒蛋白。前期通过3'-RACE方法,从皱盖罗鳞伞总RNA中克隆获得包含RC28编码区的c DNA,并通过TA克隆获得质粒p MD18-T-RC28。以该质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增RC28片段,分别插入大肠杆菌表达载体p ET28a(+)和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,形成在N端表达组氨酸标签的重组RC28表达粒体。将这两种RC28表达质粒转化各自的宿主菌后,筛选阳性克隆,构建稳定表达体系。诱导表达后,用SDS-PAGE电泳和Western blot分析RC28的表达情况。放大表达体系后用Ni-NTA柱纯化获得RC28蛋白,并用MTT法测试重组表达蛋白质的抗病毒活性。在实验条件下,大肠杆菌和毕赤酵母中均能表达可溶性重组RC28,纯化后蛋白质得率分别是3.5mg/L发酵液及0.2mg/L发酵液。但抗病毒活性实验表明,大肠杆菌体系表达的RC28蛋白活性较差,而毕赤酵母系统表达的RC28蛋白的抗病毒活性与天然蛋白接近。