贵州传统发酵豆制品中水解银杏黄酮苷的微生物β-葡萄糖苷酶筛选

[目的]微生物β-葡萄糖苷酶法水解银杏黄酮苷具有重要意义,不过目前这方面的研究极少。因此,本文目的是筛选到水解银杏黄酮苷的酶活高的微生物β-葡萄糖苷酶,并分析其底物选择性机制。[方法]以银杏叶提取物作为唯一碳源富集培养,从贵州传统发酵豆豉中筛选产对银杏黄酮苷水解酶活高的β-葡萄糖苷酶的菌株,并对该菌株进行鉴定。然后比较此β-葡萄糖苷酶对不同底物的选择性,同时测定此酶水解银杏黄酮苷反应的米氏常数Km及最大反应速率Vmax。最后,对不同的底物进行分子对接,分析其底物特异性机制。[结果]结果表明,筛选到的菌株GUXN01所产β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活最高,被鉴定为枯草芽孢杆菌。此β-葡糖糖苷酶对β构型的糖类以及苷类等具有广泛的底物特异性和不同的选择性,尤其对银杏黄酮苷具有很好的亲和性。分子对接研究表明枯草芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷和其他糖苷类具有不同亲和性和选择性的原因主要是酶结构和底物分子结构的相互作用力的差异导致的。[结论]这些发现为GUXN01所产的β-葡萄糖苷酶应用于水解银杏黄酮苷类生产相应苷元奠定了良好的基础。     

新型β-葡萄糖苷酶BglD2异源表达及水解虎杖苷能力

从海洋细菌Bacillus sp.D1中克隆、重组表达β-葡萄糖苷酶BglD2,研究其酶学性质,并对其水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力进行分析。BglD2的最适催化温度和pH分别为45℃和6.5,在30℃和pH 6.5条件下的半衰期约为20 h。BglD2能够水解含β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)等键型的多种底物。BglD2具有良好的糖促活特性,100 mmol/L葡萄糖和150 mmol/L木糖分别将酶活力提升2.0倍和2.3倍。BglD2具有较好的乙醇促活及耐受特性,30℃时,10%乙醇使酶活力提升1.2倍,25%乙醇存在时其仍保留60%的酶活力。BglD2具有水解虎杖苷制备白藜芦醇的能力,35℃条件下反应2 h水解率为86%。具有乙醇耐受及抗产物抑制等特性的β-葡萄糖苷酶BglD2在酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇方面有应用潜力。     

差异柠檬酸杆菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及分子改造

【目的】筛选鉴定1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,克隆、表达该菌株中的β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行分子改造。【方法】在自然界中采集土样,筛选到1株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,对野生菌进行16S rDNA鉴定,比对分析Gen Bank数据库中与野生菌同属的β-葡萄糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因保守区;设计引物扩增目的基因,以pQE30为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;采用镍亲和层析对重组酶进行纯化,研究其酶学性质;采用易错PCR和定点随机突变相结合的方法对野生型β-葡萄糖苷酶进行分子改造。【结果】一个来自于差异柠檬酸杆菌GXW-1的β-葡萄糖苷酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶CBGL的最适温度为45°C,最适p H为6.0,V_(max)值是(0.1704±0.0073)μmol/(mg·min),K_(cat)值为(0.2380±0.0102)/s。CBGL能水解α-pNPG、甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。对野生酶进行分子改造,获得V_(max)是野生酶2.54倍的突变体W147F。【结论】CBGL不仅具有β-1,4-糖苷键水解能力,还可能具有一定的α-糖苷键水解酶活性。此外,CBGL还能够水解天然底物甜菊苷、黄豆苷和染料木苷。这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。     

微生物发酵转化牛蒡子的研究

从牛蒡子药材中筛选到一株具有转化牛蒡子苷能力的菌株HB-2,对牛蒡子进行发酵,利用其产生的β-葡萄糖苷酶将牛蒡子苷转化为牛蒡子苷元。研究了该菌株对牛蒡子的发酵动力学,HPLC测得转化率达95%以上。发酵产物经大孔吸附树脂、硅胶柱层析及重结晶等方法制备出牛蒡子苷元纯品,并采用核磁共振(NMR)、红外(IR)、质谱(MS)等方法对产物进行了鉴定。     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选鉴定及其离子束诱变

利用经过改良的初筛培养基,以p-NPG为底物作为筛子,从葡萄园土壤及葡萄表皮中筛选到一株产β-葡萄糖苷酶酶活较高的茵株,经18S rDNA鉴定为黑曲霉.通过离子束注入技术对该茵株进行诱变,获得了一株高产β-葡萄糖苷酶诱变菌株H68,与原茵株相比,酶活提高了53%.     

酶解法提取纯化虎杖提取物中自藜芦醇的工艺研究

本文对虎杖提取物中虎杖苷的酶解条件及苷元白藜芦醇的提取纯化工艺进行研究,以样品中自藜芦醇的含量为指标,对纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、复合酶进行筛选,结果表明以复合酶的水解效率最高:采用正交实验对影响复合酶酶解的因素:加酶量、温度、酶解时间进行考察;并对酶解后提取物中自藜芦醇的提取纯化工艺进行研究.得出如下较理想的酶解条件和提取纯化工艺:虎杖提取物,加水(pH 5)10倍,加20%的复合酶,于50℃保温24 h;酶解后的提取物经水、乙醇-水、碱溶液分步溶解沉淀,得白藜芦醇粗品,含量可达65%,工艺稳定可行.     

京尼平的微生物转化及其交联特性的测定分析

从土壤中富集筛选获得一株产β-葡萄糖苷酶的菌株,经菌落的形态和18S rDNA鉴定确定为黑曲霉。将筛选出的黑曲霉菌株接种于发酵培养基,利用含有京尼平苷的栀子粉作为底物发酵,通过对发酵条件优化,得到在装液量50/250 mL,栀子粉浓度为10%,转速为180 r/min,发酵时间为96 h时,京尼平的微生物转化率达到最大22%。这种微生物转化法简化了京尼平的生产工艺,大大降低了生产成本。利用微生物转化获得的京尼平交联胶原蛋白材料,研究表明其具有较好的交联特性,是一种在食品、医药等领域都具有应用前景的生物交联剂。     

内生真菌Eupenicillium javanicum R57水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从10株东乡野生稻内生真菌中筛选到7株可转化京尼平苷合成京尼平的菌株,其中菌株R57的转化效率最高,最大转化率可达98.7%。通过菌体形态结合ITS rDNA、18S rDNA及28S rDNA序列分析,将该菌鉴定为爪哇正青霉Eupenicillium javanicum R57。菌株R57的粗酶液经硫酸铵沉淀、透析、超滤、Ez Fast DEAE FF阴离子交换层析及Sephadex G-150凝胶柱层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,其相对分子质量约为81k Da。该β-葡萄糖苷酶对京尼平苷和4-硝基苯基-β-D-吡南葡萄糖苷(PNPG)均有催化作用,但对京尼平苷的Km值最小,为0.153mmol/L,且催化效率更高;该β-葡萄糖苷酶具有较强耐酸性和耐热性,最适pH 4.6,最适温度60℃。该酶活性受K~+、Co~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)及尿素的激活,但受Cu~(2+)、Fe~(2+)、Mo~(3+)、Pb~(2+)及SDS不同程度的抑制。     

一株快速转化甜菊苷的细菌鉴定、产酶及转化特性

【目的】本研究鉴定了一株筛选的甜菊苷特异降解菌、优化了该菌产β-葡萄糖苷酶的条件以及研究了该菌对甜菊苷的转化特性。【方法】经16SrRNA基因序列测序和系统发育学分析,结合形态学特征确定该菌株的系统发育地位。用单因素及多因素分析探讨了其对甜菊苷的降解,通过液质联用检测了降解产物。【结果】菌株-J2与巨大芽孢杆菌的16SrRNA基因序列相似性达到100%,结合形态学特征,鉴定该菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。在玉米淀粉4%、豆粕粉1%、硫酸镁0.04%、pH7.0、37℃、220r/min、接种量10%、培养36h的条件下,该菌产β-葡萄糖苷酶活力为779.68U/mL。甜菊苷转化的结果表明:3d可将10mg/mL甜菊糖溶液中甜菊苷转化74%,使莱鲍迪甙A和甜菊苷的比例(RA/SS)由转化前的0.38上升至0.99,RA的相对量增加160.5%,5d时转化完全。转化产物经液质联用鉴定为甜菊双糖甙。【结论】确定菌株-J2为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),该菌对甜菊苷具有高效、特异的转化能力,为首次报道的新型、安全菌株。     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

一株产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选、全基因组分析及产酶优化

【背景】从健康甘草须根中分离获得的一株芽孢杆菌具有高产β-葡萄糖苷酶的活性。【目的】探究分离菌株潜在的产酶遗传信息,为该菌深入研究与工业应用提供数据支撑。【方法】利用七叶苷培养基进行产β-葡萄糖苷酶的益生菌筛选,筛到一株产β-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌,采用三代Nanopore PromethION和二代Illumina NovaSeq平台对菌株进行基因组测序与组装、并通过基因预测与功能注释等生物信息分析预测菌株潜在的β-葡萄糖苷酶基因。另外,以β-葡萄糖苷酶活性为指标,研究碳源、氮源、接种量、温度和起始pH对菌株产酶活性的影响。【结果】从甘草须根中分离得到一株具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株,通过形态学观察、生理生化和分子生物学试验鉴定为芽孢杆菌属菌株,并命名为Bacillus rugosus A78.1。该菌株基因组大小为4 146 938 bp,G+C含量为43.86%,共编码4 255个基因。在基因组中,共注释到碳水化合物活性酶基因192个,其中β-葡萄糖苷酶基因10个,分别属于GH1和GH3家族基因。在基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）和同源基因簇（clusters of orthologous groups of proteins,COG）数据库分别注释到2 896、4 019和3 657个基因。该菌株基因组测序结果上传至NCBI获得GenBank登录号为CP096590。菌株A78.1产β-葡萄糖苷酶的最佳碳、氮源分别为0.5%葡萄糖、1.0%酵母浸粉,最佳培养条件为温度37℃、3%接种量、pH 6.0,此条件下β-葡萄糖苷酶活力可达到（5.640±0.085） U/mL。【结论】通过全基因组测序分析及产酶优化试验确定了Bacillus rugosus A78.1优良的产β-葡萄糖苷酶能力及在碳水化合物代谢方面的潜力,为该菌株在纤维素分解、糖苷类化合物水解等生物、化工和食品领域的研究与应用提供基础。     

重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化

摘要：【目的】β-葡萄糖苷酶可用于酶法生产龙胆低聚糖。为了给龙胆低聚糖的生产提供大 量的酶来源,构建基因工程菌表达黑曲霉(CMI CC 324626)β-葡萄糖苷酶基因（bgl）并研究重组酶生产龙胆低聚糖的工艺条件。【方法】将bgl克隆到表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71。表达产物通过HPLC和LC-MS鉴定了其可用于生产龙胆低聚糖的转苷活性,并对酶转化葡萄糖生产龙胆低聚糖的反应条件进行了优化。【结果】实现了β-葡萄糖苷酶的过量表达。当底物葡萄糖浓度为80%,反应pH4.5,温度为60℃,加酶量为每克葡萄糖60 U,添加1 mmol/L的K+,转化周期为48 h,龙胆低聚糖累计达到最大为50 g/L。【结论】本研究是国内外首次利用重组酶酶法生产龙胆低聚糖的报道。     

虎杖中白藜芦醇的酶法制备

以白藜芦醇得率为指标,通过对酶制剂的筛选和酶解条件的考察,分别选出酶法提取和酶法转化制备虎杖中白藜芦醇的最佳条件,并对两种酶法进行比较.结果显示:(1)酶法提取最佳酶解条件为:酶解温度45℃,酶解时间60 min,最适pH 5.0,底物浓度17%;酶法转化最佳酶解条件为:酶解温度40℃,酶解时间48 h,最适pH 5.0,底物浓度15%.(2)与空白样品(不加酶)相比,酶法提取白藜芦醇得率增加了3.12 mg/g;酶法转化白藜芦醇得率增加了12.72 mg/g.研究表明,两种方法与不加酶提取相比均提高了白藜芦醇的得率,但酶法转化效果更显著,可用于白藜芦醇的制备.     

絮凝选择载体的构建及β葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中的表达

从强絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ABXL-1D菌株中用PCRA-法扩增到絮凝基因(Flocculation gene,FLO1),构建以絮凝基因作选择标记的酿酒酵母表达栽体：用该栽体表达Bacillus polymyxa的β-葡萄糖苷酶基因,转化子可直接从沉淀中筛选。摇瓶培养细胞得到的β-葡萄糖苷酶比活力为3．91u／mg蛋白。在发酵葡萄糖和纤维二糖混合底物时,转化子的葡萄糖残存量明显低于受体菌。这将有利于利用纤维素发酵生产酒精。     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。     

黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶菌株的诱变、筛选及发酵条件优化

以黑曲霉TJ02为出发菌,对其孢子进行硫酸二乙酯化学诱变,筛选得到遗传稳定的β-葡萄糖苷酶高产菌株DES-7。诱变株DES-7产酶能力可达28 IU/mL以上,较出发菌株提高30%。同时,对该菌株的发酵培养基进行优化,以玉米芯为碳源,酵母粉和硫酸铵为氮源,其产酶能力达到39 IU/mL,较优化前提高了39.3%。此外,对该菌株的β-葡萄糖苷酶的最适温度和pH以及温度稳定性和pH稳定性进行了测定。     

人肠道产柚苷酶菌株分离、鉴定及其对柚皮苷的转化特性

【目的】从健康人肠道微生物菌群中分离能将柚皮苷高效转化为柚皮素的特定细菌菌株,对分离得到的菌株进行菌种鉴定并研究菌株对柚皮苷转化特性,目的是为柚皮素的高效生物合成提供新细菌资源。【方法】取健康人新鲜粪样,在厌氧工作站内培养24 h后进行梯度稀释并涂板,从板上挑取单菌落与底物柚皮苷进行厌氧培养,用高效液相色谱检测底物被转化情况。根据16S rDNA序列及相关生理生化特性分析,对所分离的柚皮苷转化菌进行菌种鉴定,并测定转化菌株对底物柚皮苷的转化动态和转化能力。【结果】从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,分别命名为AUH-JLD3、AUH-JLD7、AUHJLD104和AUH-JLD109。根据16S rDNA序列分析,结合形态学及相关生理生化特性等,将其分别鉴定为布劳特氏菌(Blautia sp.AUH-JLD3)、肠球菌(Enterococcus sp.AUH-JLD7)、拟杆菌(Bacteroides sp.AUHJLD104)和巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus subsp.AUH-JLD109)。转化动态研究结果表明,所分离的4株细菌菌株均能在12 h内将0.2 mmol/L底物柚皮苷转化为柚皮素;转化能力测定结果显示,菌株AUHJLD3、AUH-JLD7、AUH-JLD104及AUH-JLD109能够高效转化底物柚皮苷的最大浓度分别为0.2 mmol/L(平均转化率66.67%)、0.8 mmol/L(平均转化率86.49%)、0.2 mmol/L(平均转化率73.68%)以及1.6 mmol/L(平均转化率93.20%)。【结论】本研究首次从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,其中巴氏链球菌AUH-JLD109对底物柚皮苷转化能力最强。     

1株大熊猫肠道纤维素降解菌的分离鉴定及其酶学性质

以羧甲基纤维素钠为唯一碳源,利用刚果红染色法,从大熊猫粪便内筛选具有降解纤维素能力的菌株,并研究其酶学特性。分离获得1株酶活力较高的菌株A1,通过形态学和BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。菌株A1最适生长条件和酶活力测定表明,其最适生长温度为37℃,Na Cl浓度为0.5%,p H值为7.0,内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和总酶活的最大值分别为0.139、0.074、0.126、0.108 5 IU/m L。丰富了大熊猫肠道纤维素降解菌的种类,为后续研究大熊猫如何消化利用竹纤维提供了菌源。     

产β-葡萄糖苷酶的菌种的筛选,鉴定及其酶学特性

β-葡萄糖苷酶来源广泛,几乎存在于所有的生物体中,而不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质也各不同.本文利用七叶苷分离培养基从土样中分离筛选出产6种β-葡萄糖苷酶时间较快的菌种,其中发现菌种WGEA1酶活性较高,随后对菌种WGEA1进行初步的鉴定并且采用DNS法测该菌株所产粗酶液的酶学特性.酶学特性表明,WGEA1产的β-葡萄糖苷酶最适温度是在50~55℃之间,最适pH在6~7之间;在低于50℃条件下,pH为5~8时,酶活较稳定,同时在最适反应时间30 min下,金属离子和有机溶剂都对酶活性影响很大,这些发现都为在非水相体系中酶法合成烷基糖苷奠定了一定的基础.