牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

牙鲆甲状腺激素受体TRaA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

雌激素受体参与疼痛调控的研究进展

雌激素受体属转录因子核受体超家族成员。雌激素受体的两个亚型ERα和ERβ都有类似于核受体超家族成员的调节结构,介导雌激素参与生理和病理过程中的多种效应。ERα和ERβ广泛分布于神经系统中疼痛调节相关的区域,大量动物实验及临床研究资料证实ERα和ERβ参与急、慢性疼痛的调控。本文拟对雌激素受体的特性及其在疼痛调控中的作用予以阐述。     

甲状腺激素受体在扬子鳄卵巢中的免疫组织化学定位和不同繁殖时期的mRNA表达水平变化检测

目的研究扬子鳄甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor,TR)基因的系统进化关系和在卵巢组织中的定位,分析成年扬子鳄在不同繁殖活动期卵巢组织中甲状腺激素受体的动态变化规律。方法通过Clustal W软件对扬子鳄和其它脊椎动物TRs氨基酸序列进行序列比对,使用MEGA 6.0软件构建NJ系统发育树;应用q RT-PCR方法检测TRα和TRβm RNA在不同繁殖时期卵巢组织中的表达水平差异;应用免疫组织化学法对扬子鳄卵巢卵泡中TR进行组织定位。结果系统发育分析显示扬子鳄与鸟类亲缘关系较近;扬子鳄卵巢中TR的m RNA表达水平在繁殖期最高,在繁殖前期和繁殖后期相对较低;免疫组织化学染色显示,TR阳性反应主要位于卵泡的颗粒层细胞、卵泡膜、卵母细胞质和卵母细胞核中,其中颗粒层细胞阳性反应最明显。结论 TR基因的进化时间较早,因此序列保守性较高;TRα和TRβ对扬子鳄卵泡发育成熟具有重要作用;颗粒层细胞是TRs的功能作用主要位点。     

乏氧诱导因子结构、表达及调控

乏氧诱导因子（HIF）是乏氧应答中起重要作用的转录因子,一直是乏氧研究的焦点.HIF由α亚基和β亚基组成,α亚基包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,其中α亚基因诱导条件不同通过选择性剪接产生不同变体.β亚基包括ARNT、ARNT2和ARNT3.α与β亚基在乏氧等应激反应时形成二聚体HIF启动靶基因转录表达,参与多种细胞生物学功能的调控.目前为止,大多数的研究都集中于野生型HIF-1α,对它的结构、表达调控及其调控做了相对全面而清楚的了解.后来通过多种策略及方法,陆续发现并克隆出了除HIF-1α外的HIF各亚基.研究不再局限于HIF-1α,而是扩展至HIF整个系统,如相继发现的HIF-2α和HIF-3α亚基,以及它们的变体,对HIF-1α的研究也更深入了,但是关于HIF-1α的变体、HIF-2α、HIF－3α及β亚基的表达调控及功能还不明确,是未来研究的方向.本文全面介绍HIF的最新研究进展,阐述HIF各亚基的结构、表达调控及其靶基因的表达情况.     

PKC对人mdr1基因转录调控的研究

研究了ＰＫＣα、β１和β２亚型对多药耐药基因ｍｄｒ１转录的调控作用．以ｍｄｒ１基因上游调控序列驱动的虫荧光素酶报告基因表达载体和ＰＫＣ基因表达载体共同转染ＣＯＳ７细胞后,测定虫荧光素酶报告基因表达水平．实验结果表明,ＰＫＣα、β１及β２对ｍｄｒ１基因的转录有下调作用,ＰＭＡ可进一步加强这一作用;在此转染体系中,ＰＫＣ抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ也可抑制ｍｄｒ１基因的转录,但在只转染ｍｄｒｌｕｃ的细胞中,ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ对ｍｄｒ１的转录则没有影响,提示ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ仅在ＰＫＣ过量表达的细胞中抑制ｍｄｒ１基因的转录．     

β-连环素与肿瘤研究进展

β-连环素(β-catenin)作为一种重要的信号转导分子和细胞间黏附分子,是近年来研究异常活跃的蛋白。多项研究结果显示β-连环素是Wnt信号转导通路的关键调控点并是构成粘附连接的E-cd/cat复合体的胞内重要组份,并通过与多种蛋白的结合参与肿瘤的发生发展、增殖分化、侵袭转移等生物学过程。本文阐述了β-cat基因、蛋白结构、表达调控、其降解与其丝/苏氨酸磷酸化的关系、及其在细胞内转运与APC基因的调控机制的联系、其出入细胞核及核内活化转录的分子机制、β-cat作为E-cd/cat复合体重要组分如何参与肿瘤浸润、转移过程;探讨了β-cat同时参与Wnt信号转导通路及E-cd/cat复合体构成的双重功能之间的辩证联系,对β-cat研究和应用前景提出了相应的设想和展望。     

核受体TR3/Nur77与肿瘤治疗

核孤儿受体TR3(也称Nur77)是NR4A1编码的立早基因产物,属于类固醇/甲状腺受体/视黄酸受体超家族成员。TR3广泛参与各种生命活动过程,如细胞生长、分化、凋亡和自噬等调控,被认为是良好的抗肿瘤药物设计靶标。TR3不仅作为转录因子通过结合DNA应答元件调控基因的转录和表达,而且还能作为调节蛋白通过蛋白相互作用和亚细胞不同定位发挥独特的作用。该文重点综述了TR3在肿瘤发生发展中的功能和调控机制,及以TR3为靶标治疗肿瘤的药物研究进展。     

ERα的辅调节因子与乳腺癌关系的研究进展

雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）是配体依赖的转录因子,属于核受体超家族成员。ERα介导转录的经典途径是与雌激素结合后作用于靶基因启动子区的雌激素反应元件（estrogen response element,ERE）,进而诱导靶基因转录。ERα招募辅调节因子（共激活子和共抑制子）参与ERα介导的基因转录调控。辅调节因子主要通过乙酰化、磷酸化、甲基化等表观遗传机制参与转录调控,影响靶蛋白表达水平。ΕRα介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭转移等过程中发挥重要作用。综述在ERα介导的基因转录调控中几类辅调节因子对乳腺癌发生发展的影响。     

降钙素基因相关肽在突触可塑性调控和情绪记忆中的作用

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由降钙素基因表达的一种神经肽类物质,分为α和β两种亚型。CGRP在人体内广泛分布,在外周和中枢神经系统中高表达。研究表明CGRP参与多种生理和病理生理活动,包括伤害性感觉信号的形成与传导、心血管功能的调节作用等。近年来越来越多的研究表明,在中枢神经系统中CGRP参与突触可塑性调控,并与认知和学习记忆功能密切相关。本文综述了CGRP在突触可塑性调控和情绪记忆中的作用研究进展,以期为临床治疗相关神经系统疾病提供新的分子靶点和理论依据。     

乙酰胆碱受体α4β2亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

通过建立乙酰胆碱受体α4β2亚型(α4β2 nAChR)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,以便以α4β2 nAChR为作用靶点进行药物筛选。将乙酰胆碱受体亚基基因α4、β2体外转录获得的cRNA,通过显微注射的方法注入非洲爪蟾卵母细胞,并对该受体的表达情况进行检测。结果显示,乙酰胆碱受体α4β2亚型在蛙卵细胞中获得了有效表达,记录到典型的ACh配体门控的离子通道内向电流。     

雌激素受体β与相关肿瘤研究进展

雌激素通过与特定的雌激素受体相互作用发挥重要的细胞生长和分化作用。雌激素受体是属于细胞核受体超家族的配体依赖性的反式作用子。尽管最初认为雌激素由单一的受体,即传统的雌激素受体,现称为ERα介导其作用,第二个ER新亚型,现称为ERβ,1996年被发现,并由此引发了一场对于雌激素在正常生理学和疾病过程的作用重新评价。自从发现ERβ以来,其作为相关肿瘤的预警因子以及其潜在的作为药物介入的新靶点的价值成为研究热点。在过去的10年中,我们对雌激素信号的理解有很大改变。现在,已知ERα和ERβ组织细胞分布和功能不同。ERβ存在于许多正常和疾病组织中,包括生殖系统和其他组织器官的恶性肿瘤,如乳腺、子宫内膜、卵巢、前列腺和结肠直肠癌以及其他肿瘤。因此,ERβ在这些肿瘤的发生发展和治疗方面的作用引起了人们越来越多的关注。现就ERβ在雌激素相关肿瘤的发生、发展、预后评估以及治疗意义进行综述。     

电压门控钠通道的β亚基调控机制

电压门控钠通道是细胞电兴奋的重要分子基础,由一个α孔道亚基和单个或多个β辅助亚基构成。β亚基以直接与钠通道α亚基结合或以细胞粘附分子方式,组合或单独调节α亚基的表达定位及门控特性。因此,β亚基与α亚基不同亚型的细胞特异性表达组合,是神经元内在特性的内源性调控机制之一。本文基于钠通道β亚基不同亚型差异表达与功能的多样性调控,解析疼痛、癫痫等通道病发生发展的β亚基相关机制,以期为靶向电压门控钠通道的临床诊疗和新药发现提供新策略。     

β－连环素研究新进展

β-cat作为一种重要的细胞间黏附分子和信号转导分子。并通过与多种蛋白的结合参与细胞和组织的发育分化、损伤修复、肿瘤的发生发展及其它生物学过程。本文对近年来在β—cat的晶体结构特点、β-cat的降解与其丝／苏氨酸磷酸化的关系、及其在细胞内转运与APC基因的调控机制的联系、其出入细胞核及核内活化转录的分子机制以及β-cat研究的应用前景等方面的进展作一综述。     

LEF-1的调控及其与肿瘤的关系研究进展

淋巴细胞增强因子（lymphoid enhancer factor,LEF-1）是Wnt信号通路中的一个重要调控因子。其异常表达对肿瘤细胞增殖和凋亡调控起关键作用。LEF-1作为Wnt信号通路核内的转录因子,还与T细胞受体α（TCRα）的增强子相互作用形成特定的构象,从而与其他因子结合共同调节基因的表达。同时,LEF-1为一多启动子基因,编码产生致瘤的全长形式的LEF-1和对Wnt信号通路起负向调控作用的截短形式的LEF-1。诸多研究结果表明肿瘤的发生发展与LEF／TCF各亚型的比例有关。就Wnt／LEF-1信号通路的调控以及与肿瘤的关系做一综述。     

雌激素受体β亚型

1996年发现雌激素受体存在亚型,即ERβ。ERβ与ERα结构相似。广泛分布于多种组织内,其表达受体激素的影响但不依赖于ERα,并与组织分化、发育过程相关。ERβ可能在生殖系统和神经系统中发挥重要作用,还可能参与肿瘤发生与进展过程ERβ与ERα在体内分布、与配体亲和力、促转录活性上存在差异,对ERβ及其特异性配体的进一步研究具有重要意义。     

PIG7基因与Litaf／Simple蛋白

PIG7基因是与p53诱导凋亡密切相关的基因,与代谢、炎症、肿瘤等关系紧密。该基因可能存在2种不同的转录本——Litaf与Simple,Litaf在LPS诱导TNF-α表达过程中起转录激活作用,Simple可能参与溶酶体介导的细胞内蛋白分选和降解过程。     

p63亚型及其与疾病的相关性

p63足p53家族成员的核转录因子,根据N端及C端的不同,已经发现TAp630α、TAp63β、rap63y、ANp630α、△Np63β、△Np63β、△Np63δ、△Np63δ种亚型。p63的表达受到多种转录因子的调控,其mRNA的稳定性由RNPCI调节,蛋白的稳定性主要由HECT家族成员Itch／AIP4、WWPI调节。p63在上皮细胞分化、组织发育过程中起着关键性作用,因此,p63基因突变可以导致外胚层发育不良的相关疾病,同时,p63在肿瘤的形成和转移的过程中具有重要的调控作用。     

棉蚜乙酰胆碱受体亚基的选择性剪接和多重转录起始位点分析

乙酰胆碱受体在神经突触传导过程中具有重要作用,也是氯化胆碱类杀虫剂的作用靶标。采用RACE技术,成功地从棉蚜中克隆了3个nAChR亚基,其中2个为α亚型, 1个为β亚型,分别命名为Agα1、Agα2和Agβ1。通过锚定mRNA的5′mG结构, 5′RACE结果表明Agβ1有三个不同的剪接变体,具有不同长度的5′UTR区,表明Agβ1亚基具有多重的转录起始位点。其中,最短的剪接变体Agβ1C在蛋白编码区域也存在选择性剪接,位于D环区域的186 bp碱基缺失。3′RACE实验结果表明,Agα1亚基虽然具有ploy ( A)和加尾信号AATAAA等完整的mRNA基因结构,但缺失了终止子和乙酰胆碱受体α亚基保守的第4个跨膜区,文中对此做了进一步分析。分子进化树的分析表明,昆虫乙酰胆碱受体亚基应当被划分为三个不同的亚类群αⅠ,αⅡandβ。本文的研究揭示了昆虫乙酰胆碱受体亚基复杂的基因结构[动物学报51 (5) : 867 -878 , 2005]。