猪苓菌丝形成菌核的MAPK基因克隆及表达分析

【目的】克隆药用真菌猪苓MAPK基因并进行生物信息学分析及表达模式研究。【方法】利用5′-RACE-PCR技术从猪苓菌丝中克隆得到MAPK基因全长,利用生物信息学软件推测蛋白的理化性质、结构域;DNA Star对氨基酸进行多序列比对;用MEGA 5.0做进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。【结果】猪苓MAPK基因的全长cDNA为1 293 bp,其中编码区占1 161 bp,共编码386个氨基酸,推测分子量为43.872 kD,理论等电点为6.68。猪苓的MAPK有MAPK中ERK1/2类型的保守区。系统进化树结果显示猪苓MAPK蛋白属于担子菌类群。实时荧光定量PCR分析结果表明猪苓菌核形成初期,菌核中的MAPK表达量显著高于菌丝组织,随着菌核的快速生长而减少。【结论】猪苓MAPK基因PuMAPK的分子特征为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定基础。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

红花花青素合成酶基因的克隆及表达分析

根据红花转录物测序结果中得到的中间序列,采用R11-PCR和RACE方法从红花花瓣中克隆到1个4嬲基因的全长cDNA,该基因全长序列1226bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1050bp,编码349个氨基酸。生物信息学软件分析显示,该基因编码的蛋白理论分子量约为82．27kDa,等电点为5．09,序列里含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly（A）。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的ANS蛋白功能结构域,其保守结构域中含有铁离子及2．0-酮戊二酸结合位点。结合其他物种的臌因构建系统树表日月,红花ANS蛋基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与芍药的亲缘关系最近。应用实时荧光定量PCR分析表明,ANS基因在红花的初花期和盛花期的表达量最高。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)NFκB抑制因子α基因PaIκBα克隆及表达

核转录因子κB抑制因子α(IκBα)是NFκB/IκB信号传导通路的重要成员,参与机体抗细菌感染等多种免疫反应,可通过蛋白质间的相互作用结合核转录因子NFκB,从而调控生物体多种免疫基因表达。该研究采用RACE技术从香鱼中克隆得到核转录因子κB抑制因子PaIκBα基因的cDNA全长序列(1341bp,GenBank Accession No.JN801027),开放阅读框ORF为936bp,编码311个氨基酸,5’非编码区为64bp,3’非编码区为341bp。生物信息学分析表明,香鱼IκBα蛋白的序列中包含5个保守的锚蛋白重复序列,N末端含有信号诱导蛋白,C末端含有PEST序列。同源性比对结果表明,香鱼IκBα蛋白与胡瓜鱼IκBα的同源性最高,为95%;其次是大西洋鲑、虹鳟、尼罗罗非鱼和鳜鱼等,同源性分别为76%、75%、70%和68%。系统进化树分析表明,香鱼IκBα蛋白与胡瓜鱼、虹鳟、尼罗罗非鱼、鳜鱼和大西洋鲑等亲缘关系最近。RT-PCR分析表明,PaIκBα基因在香鱼肝脏、肾脏、脾脏和鳃中表达水平较高,其次是肠、脑和肌肉,在心脏中表达极少。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophil)感染香鱼后,PaIκBα基因表达增强,感染24h达最大值,表明PaIκBα基因在香鱼受到嗜水气单胞菌刺激的免疫过程中可能发挥着重要作用。     

猪Gli1基因的克隆、表达谱分析及脂肪组织特异性表达载体的构建

Hedgehog(Hh)信号通路对动物脂肪沉积具有抑制作用,并且从果蝇到脊椎动物具有高度保守性,但在家猪研究中鲜见报道。文章选择家猪Hh通路的转录激活因子Gli1进行研究,通过RT-PCR结合RACE技术,首次获得家猪Gli1基因cDNA全长,利用Real-time PCR对家猪Gli1基因在不同组织中的表达丰度进行了分析,并构建了真核表达载体和脂肪组织特异性表达载体。结果表明:猪Gli1基因cDNA全长3 576 bp,基因组序列全长10 715 bp,共12个外显子,编码1 106个氨基酸。生物信息学分析表明,猪Gli1为不稳定亲水性蛋白,不具有跨膜结构域和信号肽序列,但具有锌指结构与核定位序列。对7个物种的Gli1蛋白序列和基因组序列相似性进行分析,发现各物种间序列相似性均在80%以上,说明Gli1在物种间高度保守。组织表达谱分析表明,Gli1仅在成体猪舌组织中表达;在家猪脂肪组织发育进程中,Gli1仅在出生1周的猪脂肪组织中检测到微弱表达,但1月龄及3月龄猪脂肪组织中均检测不到表达,由此推断猪Gli1表达与脂肪组织发育呈负相关。最后,将猪Gli1编码区克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,体外转染实验证明该载体能够正确表达猪Gli1,另外还构建了脂肪组织特异性表达载体,为构建脂肪组织特异性转基因动物奠定基础。     

猪I-FABP基因的分子克隆与组织特异性表达分析

小肠型脂肪酸结合蛋白对长链脂肪酸具有高度的亲和力,参与脂肪酸的吸收和细胞内转运。利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术并结合同源克隆策略,克隆到了编码猪小肠型脂肪酸结合蛋白基因（I-FABP）的全长cDNA序列（GenBank接受号：AY960624）,并对系统发育关系等进行了生物信息学分析。猪I-FABP基因的cDNA序列全长614 bp,其中包括399bp的开放式读码框（ORF）,43bp的5’末端非编码区（5’URT）和172bp的3’末端非编码区（3’URT）,编码132个氨基酸残基蛋白,在氨基酸水半上与其他物种的I-FABP具有高度的同源性。以邻接法（Neigbor-Joining,NJ）所构建的系统发育关系表明,猪I-FABP与其他物种的,I-FABP属于同一类群,且与人的遗传距离最近。Northern杂交和半定量RT—PCR分析发现,猪I-FABP在猪体组织中出现约620bp大小的转录本,且在猪体组织中广泛存在,但在小肠组织中表达量最为丰富。     

马氏珠母贝Caspase-3基因克隆和组织表达分析

半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)作为细胞凋亡通路中重要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用.为初步探究马氏珠母贝Caspase-3(PmCaspase-3)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmCaspase-3基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法分析了PmCaspase-3基因mRNA在马氏珠母贝不同组织和不同发育时期的表达差异.结果 显示,PmCaspase-3基因cDNA全长为2233 bp,其中5'端非编码区长度为80 bp,3'端非编码长度为31 bp,开放阅读框长度为2088 bp,共编码695个氨基酸;生物信息学分析显示,PmCaspase-3含有Caspase家族特有的CASc结构域和半胱氨酸蛋白酶家族p20、p10活性位点以及多种磷酸化位点,经进化分析以及多序列比对可知与其他物种Caspase-3蛋白同源性较高.RT-qPCR结果表明,PmCaspase-3在肝胰腺中的表达量最高,在闭壳肌中的表达量最低;在发育过程中D型幼虫期和眼点期的表达量较高.     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。     

盐藻小G蛋白基因(DsRab)的克隆及在高盐胁迫下的表达分析

采用RT-PCR和RACE技术扩增了杜氏盐藻小G蛋白基因cDNA全长序列(GenBank Accession No.JN989548),命名为DsRab,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR方法检测盐胁迫下该基因的表达情况。结果表明,DsRab基因的cDNA全长为1 299 bp,开放阅读框(ORF)为612 bp,编码203个氨基酸,5’非编码区78 bp,3’非编码区609 bp;保守性结构域分析可知编码的小G蛋白有4个GTP/GDP保守结构域,1个效应区、1个羧基端的半胱氨酸结构域和5个Rab亚家族共有的结构域;二级结构预测表明该蛋白有32.02%的α-螺旋,23.65%的伸展片段,44.33%的自由卷曲,三维建模成功;比对分析发现DsRab蛋白与多种生物的Ypt/Rab的氨基酸序列具有较高的同源性。荧光定量PCR结果表明,盐藻在高盐(3.0 mol/L)胁迫下,DsRab基因表达量显著上调,1 h后表达量达到最大值,为正常培养下对照组(0 h)的4.9倍,差异极显著(P<0.01)。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

德国小蠊Akirin基因的克隆及表达分析

Akirin基因是新近发现的在果蝇NF-κB依赖的Imd信号通路调控中不可或缺的转录因子。在除果蝇以外的昆虫中,Akirin基因是否参与Imd通路的调控,亦或对NF-κB依赖的Toll通路也有调控作用还未有报道。本研究旨在初步研究德国小蠊Blattella germanica中Akirin基因的基本特征、在不同组织中的表达模式及注射法RNAi实验对Akirin基因沉默效果,以期为Akirin基因功能的研究奠定基础。通过与已报道的其它昆虫的Akirin基因进行同源比对,利用RACE(rapid amplification of c DNA ends)技术,成功从德国小蠊中克隆到1个Akirin基因,该基因全长864 bp,开放阅读框(ORF)大小为543 bp,编码180个氨基酸。蛋白序列比对及进化树结果显示,Akirin基因有非常保守的核定位信号序列,且与内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis的亲缘关系最近,同源性为86%。荧光定量PCR的结果表明Akirin基因在德国小蠊检测的4个组织中均有表达,但表达水平有差异,在血淋巴的表达水平最高,其次为脂肪体。通过注射法RNAi实验成功抑制了Akirin基因的表达水平,并且RNAi的效果随时间的延长而更强,在注射72 h后,Akirin基因m RNA的表达水平下降了90%。上述研究为Akirin基因的功能及德国小蠊防治研究提供了科学依据。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

池蝶蚌IκBα和c-Rel的结构特征及在LPS刺激下的表达分析

为研究淡水贝类NF-κB/Rel信号通路中核因子κB(Nuclear factor-κappaB, NF-κB)和NF-κB抑制因子(Inhibitors of NF-κB, IκB)的功能,对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)IκBα和c-Rel(以下简称HsIκBα和Hsc-Rel)的序列结构、表达特征及Hs IκBα和Hsc-Rel之间的相互关系进行了分析。结果表明, Hs IκBα的c DNA全长为1783 bp,其开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为1083 bp,编码360个氨基酸。Hsc-Rel的cDNA为2414 bp, ORF为2298 bp,编码765个氨基酸。通过构建HsIκBα-ORF-GST和Hsc-Rel-RHD-HIS重组质粒、原核诱导表达和纯化,进行GST-pull down,通过SDS-PAGE和Western Blot检测研究,发现HsIκBα和Hsc-Rel-RHD存在直接的相互作用。通过对池蝶蚌进行脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激后,分别在7个时间点(0、6h、12h、24h、...     

花生NBS-LRR类基因的克隆及表达特性分析

基于花生转录组及基因组数据,克隆获得一个花生的NBS-LRR类抗逆基因的全长序列,该基因与大豆抗病性蛋白基因(KHN40407.1)的相似性为79%,命名为AhNDrp基因。该基因不含内含子,cDNA全长2 832 bp,有5个典型的抗逆性蛋白保守结构域,其中DomainⅤ是富含亮氨酸的重复序列。荧光定量PCR分析表明,AhNDrp基因在花生根中特异性表达,且黄曲霉处理后该基因表达量显著上升,说明该基因可能参与抗病反应。     

人脑内-含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因,以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增,将经琼脂糖DNA电泳 鉴定获得的一约1200bp大小的特异性条带回收,并克隆入Teasy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序. 所得序列进行生物信息学分析BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列,读框分析表明,该序列中存在 一完整编码区,编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白(ACP)样结构域. 随后,经3'RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2024bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子, 15个内含子,该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1 表达载体,经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆人pGEX-4T1表达载体后,转入 JM109宿主菌,经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明,该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

fruitless在桔小实蝇求偶和交配行为中的作用

【目的】fruitless(fru)是昆虫求偶和交配行为中的关键基因,但是其在桔小实蝇Bactrocera dorsalis中的具体功能尚不清楚。本研究旨在明确fru在桔小实蝇求偶交配行为中的作用,进一步明确fru的生物学意义。【方法】根据NCBI上桔小实蝇fru的预测序列设计两端引物,以桔小实蝇羽化10 d已交配的成虫头部cDNA为模板克隆fru基因的全长cDNA,并对其编码蛋白的结构域进行预测。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在桔小实蝇交配前后表达量的变化。待合成fru基因的dsRNA后,注射到羽化9 d后的桔小实蝇雄成虫腹部进行RNAi,分别于注射后48 h和72 h取样,检测fru基因的相对表达量;并于RNAi后72 h进行求偶交配行为观察,测定桔小实蝇的交配频率和交配持续时间。【结果】克隆获得桔小实蝇fru的全长cDNA,长2 865 bp,编码954个氨基酸,预测蛋白分子量104.1 kD,等点为6.01。该基因所编码的蛋白具有特殊结构域,分别为一个BTB (Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-bric)结构域和两个...     

欧李DAM5基因的克隆及表达分析

休眠相关MADS-box(DAM)基因在植物芽休眠诱导过程中发挥重要作用。该研究以欧李‘农大4号’不同阶段的芽为材料,利用PCR技术,克隆获得ChDAM基因。ChDAM基因全长705 bp,编码234个氨基酸。多序列比对与结构域分析发现,ChDAM基因编码的蛋白具有典型的MADS-box结构域和K-box结构域,其氨基酸序列与桃的DAM5蛋白相似性较高。启动子分析发现,ChDAM5基因的表达可能会受到低温和脱落酸的调控。实时荧光定量PCR分析发现,ChDAM5基因的表达随着休眠诱导进程逐渐升高。研究推测,ChDAM基因在诱导欧李芽休眠中发挥关键作用,为后续深入的代谢途径研究奠定了基础。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。