利用基因组学和MALDI-TOF MS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物

【目的】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法基于微生物的特征蛋白指纹图谱鉴定菌种,本研究利用基因组学和MALDI-TOFMS技术鉴定放线菌纲细菌的核糖体蛋白质标志物。【方法】从MALDI-TOF MS图谱数据库选取放线菌纲代表菌种,在基因组数据库检索目标菌种,获取目标菌株或其参比菌株的核糖体蛋白质序列,计算获得分子质量理论值,用于注释目标菌株MALDI-TOFMS指纹图谱中的核糖体蛋白质信号。【结果】从8目,24科,53属,114种,142株放线菌的MALDI-TOFMS图谱中总共注释出31种核糖体蛋白质。各菌株的指纹图谱中核糖体蛋白质信号数量差异显著。各种核糖体蛋白质信号的注释次数差异显著。总共15种核糖体蛋白质在超过半数图谱中得到注释,注释次数最高的是核糖体大亚基蛋白质L36。【结论】本研究找到了放线菌纲细菌MALDI-TOF MS图谱中常见的15种核糖体蛋白质信号,可为通过识别核糖体蛋白质的质谱特征峰鉴定放线菌的方法建立提供依据。     

基于核糖体蛋白质标志物及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术快速鉴定糖丝菌属放线菌

【目的】糖丝菌属(Saccharothrix)是一类丝状稀有放线菌,在生物医药、工业酶制剂和环境修复等领域展现出应用价值。本研究尝试建立以核糖体蛋白质为标志物,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术鉴定糖丝菌属放线菌的方法。【方法】检索基因组数据库,提取糖丝菌属测序菌株15种核糖体蛋白质的序列并计算理论分子量;通过分子量比对分析糖丝菌属不同菌种之间及其模式菌株与邻近属菌种模式菌株之间15种核糖体蛋白质的匹配度,提出鉴定至菌种及属的核糖体蛋白质匹配数标准;选取目标属和非目标属菌种进行MALDI-TOF MS测试和分析并修正鉴定标准。【结果】将待测菌株的MALDI-TOF质谱峰与糖丝菌属各菌种模式菌株的15种核糖体蛋白质分别匹配,通过最大匹配数、质谱峰强度模式及特征质谱峰鉴定至属或种。【结论】本研究建立了基于15种核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术鉴定糖丝菌属放线菌的方法,可用于定向筛选和快速鉴...     

基于核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术快速鉴定伦茨菌属放线菌

【目的】伦茨菌属(Lentzea)放线菌(Actinobacteria)代谢产物具有广泛的生物活性,在医药领域展现出潜在的应用价值。本研究尝试建立以核糖体蛋白质为标志物,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight masss pectrometry,MALDI-TOF MS)技术鉴定伦茨菌属放线菌的方法。【方法】检索基因组数据库,提取伦茨菌属菌种模式菌株15种核糖体蛋白质的序列并计算理论分子量;通过分子量比对分析伦茨菌属菌种模式菌株之间及其与邻近属菌种模式菌株之间15种核糖体蛋白质的匹配度,提出鉴定至菌种及属的核糖体蛋白质匹配数标准;选取目标属和非目标属菌种进行MALDI-TOFMS测试和分析并修正鉴定标准。【结果】将待测菌株的MALDI-TOF质谱峰与伦茨菌属各菌种模式菌株的15种核糖体蛋白质分别匹配,通过最大匹配数及质谱峰强度模式可鉴定至属或种。【结论】本研究建立了基于15种核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术鉴定伦茨菌属放线菌的方法,可为放线菌纲其他类群的快...     

铜陵铜尾矿废弃地生物土壤结皮中的蓝藻多样性

生物土壤结皮是生态系统原生演替过程中的一个早期阶段,在铜陵铜尾矿废弃地自然生态恢复过程中生物土壤结皮在尾矿废弃地表面广泛分布.以生长在铜陵杨山冲和铜官山2处铜尾矿废弃地的生物土壤结皮为研究对象,运用常规培养方法和变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对不同群落生物土壤结皮中的蓝藻多样性及优势类群进行研究.结果表明2种研究方法所获得的蓝藻种类组成具有明显差异.显微观察结果表明常规培养试验中主要蓝藻类群为微囊藻属(Microcystis)、色球藻属(Chroococcus)、颤藻属(Oscillatoria)、念珠藻属(Nostoc)和浮鞘丝藻属(Planktolyngbya),其中优势种类主要为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、断裂颤藻(Oscillatoria fracta)和细浮鞘丝藻(Planktolyngbya subtilis);提取样品中微生物总DNA,对蓝藻16SrRNA进行PCR-DGGE分析,回收DGGE图谱中24个条带进行测序分析,结果显示,所有序列与GenBank数据库中的近缘蓝藻的相似性系数均在93％以上,其中优势蓝藻类群主要隶属于微鞘藻属(Microcoleus)和细鞘丝藻属(Leptolyngbya),裸地(YL)处和木贼群落下尾矿表面(YM)的生物土壤结皮中优势蓝藻类群主要为微鞘藻属,而黄色真藓-藻类混合结皮(YT)和白茅群落( YB,TG)下的生物土壤结皮中的优势类群主要隶属于细鞘丝藻属.     

三种水华蓝藻对不同磷浓度生理响应的比较研究

本实验研究了铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB469)、水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae FACHB245)和浮游颤藻(Oscillatoria planctonicaFACHB708)对磷浓度变化的生理响应。结果表明,在缺磷条件下,A. flos-aquae对低磷环境的适应能力较强,O. planctonica其次,M. aeruginosa最差;在磷充足条件,微囊藻对磷过量吸收的能力明显高于其他两种蓝藻。三种蓝藻胞外碱性磷酸酶活性(APA)与培养基中磷浓度呈负相关性,其产生碱性磷酸酶(AP)的能力由高至低为:A. flos-aquae>O. planctonica>M. aeruginosa。磷缺陷时A. flos-aquae产生的胞外APA约是M. aeruginosa的10倍,是O. planctonica的5倍。     

应用RT-qPCR技术定量检测湖泊水体中蓝藻方法的比较

利用RT-qPCR技术建立了对湖泊水体中的微囊藻和蓝藻的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,在所建立的方法中,对以微囊藻藻蓝蛋白基因、蓝藻16S rRNA基因、微囊藻16S rRNA基因分别作为RT-qPCR检测的目的基因所得结果进行了比较,并对实验室培养的微囊藻和太湖的环境样品进行了检测。结果表明,用藻蓝蛋白基因作为检测目的基因,以M.aeruginosa PCC 7806基因组DNA作为标准品的测定方法与显微镜计数的结果有较好的相关性和一致性,并具有简便、快速、特异性高的特点,可以满足检测的要求。     

江苏省水产品中溶藻弧菌分布情况

随机采集江苏省各地区的超市和农贸市场鲜活水产样品252份,参考国家标准中副溶血性弧菌的检验方法,采用形态特征观察、生化特性测定并结合特异性基因测定的方法对溶藻弧菌进行分离鉴定。结果显示,252份样品中共有198份分离鉴定出溶藻弧菌,其分离率为79%。其中,淡水产品的检出率为76%,海水产品的检出率为81%。淡水鱼中的溶藻弧菌检出率低于淡水虾贝类产品和海水产品;沿江地区的又高于沿海地区和内陆地区,农贸市场的高于超市。结果表明,海水产品与淡水产品中溶藻弧菌的携带情况非常普遍。     

血清SELDI蛋白质指纹图谱在乳腺癌术前分级中的应用

应用SELDI技术和生物信息学方法从血清中筛选能反映乳腺癌术前分期的蛋白质峰并构建检测模型。采用CM10芯片,对34例Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者和31例Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的血清进行了检测,发现11个蛋白质峰在两组患者之间表达量有显著性差异（P<0.05）,M/Z为 M2042.87、M2459.83、M3881.37、M4804.47、M6683.24和 M6706.06的6个蛋白质峰被选为分类变量构成决策树分类模型,该模型的交叉验证（测试组）总准确率为80.0%,Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌检出率为82.4%,Ⅲ～Ⅳ期检出率为77.4%。SELDI技术在乳腺癌患者术前分级的判断方面具有一定的应用价值。     

淀山湖浮游植物群落特征及其演替规律

为探明淀山湖浮游植物群落结构演变与富营养化之间的关系,于2004-2006年对上海市最大天然淡水湖泊淀山湖的浮游植物进行逐月采样调查,分析其群落结构特征.共采集到淀山湖浮游植物84属205种,主要由绿藻(种类数占50%)、硅藻(20%)、蓝藻(13%)、裸藻(13%)等组成.相邻两月之间种类相似性系数呈现冬春季高、夏秋季低的趋势:优势种为银灰平裂藻(Merismopedia glauca)、小席藻(Phormidium tenus)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、具缘微囊藻(M.marginata)、湖泊鞘丝藻(Lyngbya limnetica)、微小色球藻(Chroococcus minutus),颗粒直链藻最窄变种(Melosira granulata var.angustissima )、啮蚀隐藻(Cryptomonas erosa)、小球藻(Chlorella vulgate)和四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)等.浮游植物群落细胞数量主要由蓝藻(42.73%)、绿藻(37.75%)、硅藻(12.67%)和隐藻(6.06%)组成;生物量主要由硅藻(36.75%)、蓝藻(16.78%)、绿藻(16.36%)和隐藻03.53%)等组成.淀山湖浮游植物群落结构季节演替模式不同于PEG(Plankton Ecology Group)模型,其中蓝藻从春末开始大量出现,夏季大量繁殖,一直延续到秋初.综合文献资料看出,淀山湖浮游植物群落已从1959年的硅藻一金藻型、1987-1988年的隐藻-硅藻型演变为2004-2006年的蓝藻-绿藻型;数量由1959年的103 ind./L上升至2004-2006年的1.11×107 cells/L.演替的总体趋势表现为:贫中营养型的金藻、甲藻比例下降,富营养型的蓝藻、隐藻和微型绿藻增加.浮游植物数量和群落结构的演变指示了淀山湖水体的富营养化进程.     

生长素吲哚乙酸对铜绿微囊藻生理生化及产毒特性的影响

为了探究生长素吲哚乙酸(IAA)对产毒铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的影响, 从生长、光合色素含量、叶绿素光诱导荧光特征、脂质氧化和微囊藻毒素合成特性等方面, 研究了IAA对M. aeruginosa CHAB6301生理生化及产毒的影响。结果表明, 在低浓度IAA(0.04和0.2 mg/L)条件下, 铜绿微囊藻生长、叶绿素含量、光合系统(PSⅡ)电子传递效率及藻毒素含量均无明显变化, 藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和丙二醛(MDA)含量均低于对照。高浓度IAA(1和5 mg/L)能够促进细胞生长, 提高叶绿素含量, 但是抑制藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白含量, 降低膜脂过氧化程度和细胞内藻毒素合成。综合各指标测定结果, 低浓度IAA对M. aeruginosa CHAB6301生长和光合作用影响不明显, 而高浓度IAA可促进藻细胞生长和光合作用, 增加微囊藻水华形成几率。     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因的克隆及序列分析

克隆并测定了层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因全序列,通过将其氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,表明层理鞭枝藻中cpcE,cpcF所编码的蛋白质是层理鞭枝藻中α-CPC生命合成的连接酶。     

淡水藻种库(FACHB)库藏产2-MIB蓝藻的鉴定及其产嗅特征研究

为认识产二甲基异莰醇(2-MIB)蓝藻的形态和产嗅特征,从国家水生生物种质资源库淡水藻种库中筛选出24株可产2-MIB藻株,描述了这些藻株的形态特征和生境分布。结合形态和16S rRNA基因分析对藻株进行物种鉴定复核,修订了部分库藏藻株物种名称,例如发现库藏产2-MIB的浮丝藻属种类应当被重新鉴定为拉氏拟浮丝藻或索状气丝藻。基于mic基因系统发育树分析,显示蓝藻mic基因形成5个分支。通过2-MIB含量检测发现,不同藻株间单个细胞总2-MIB含量为6—2549 fg/cell,其含量通常为拉氏拟浮丝藻>索状气丝藻>灰假鱼腥藻。研究提供了产2-MIB蓝藻的形态、分子、生态和产嗅特性等的基础数据,首次报道气丝藻、沙丝藻、苏打丝藻种类可产2-MIB,并在国内首次报道了产2-MIB的微鞘藻,为进一步研究产2-MIB蓝藻生理生态特性提供重要的实验材料和科学依据。     

表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛查肺癌血清特异性蛋白质及其临床意义

目的:探讨用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术筛查肺癌血清特异性蛋白质的临床意义。方法:应用SELDI-TOF-MS对35例正常对照组、43例治疗前肺癌病人的血清样品进行蛋白质指纹图谱测定,用BioMarker Wizard 3．01及BioMarker Parrern System 5．01分析软件对测得的数据进行处理及建立诊断模型。结果:共检测到251个蛋白质峰,筛选出差异蛋白质峰11个,以质荷比(m/z)分别为M2799_26,M3227_41,M5739_70和M8164_30的4个蛋白质峰为依据组合构建分类决策树模型,分出5个终节点。决策树模型的原始判别总准确率为91．0%(71/78),敏感性为88．4%(38/43),特异性为94．3%(33/35);交叉验证总准确率为85．9%(67/78),敏感性为88．4%(38/43),特异性为82．9%(29/35)。结论:SELDI-TOF-MS在肺癌血清特异性蛋白质的筛选及诊断模型的建立有一定的临床意义。     

MALDI-TOF MS与16S rDNA方法对 弧菌科微生物的鉴定与系统分类学分析

目的比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)与16S rDNA方法对弧菌科微生物的鉴定及系统分类学分析能力。方法对19株弧菌科微生物,采用MALDI-TOF MS进行蛋白质图谱采集,通过对特征峰的分析,实现对微生物的鉴定和系统分类学分析;同时对19株微生物进行16S rDNA测序,用邻接法对16S rDNA序列进行鉴定和系统分类学分析,比较两种方法在弧菌科微生物鉴定和系统分类学分析中的异同。结果两种方法对19株弧菌科微生物的种属鉴定结果一致。系统分类学分析中,多株同种属的弧菌的两种方法分析结果一致,但对拟态弧菌和霍乱弧菌在树状图中的位置和亲缘关系,两种方法差异较大。结论 MALDI-TOF MS与16S rDNA均能够快速准确地鉴定弧菌科微生物,但利用MALDI-TOF MS进行系统分类学分析还有待数据库的扩大及算法的优化。     

KCl诱导柱胞鱼腥藻形成液泡

蓝藻营养细胞的亚显微结构,很早就已进行了深人的研究．人们知道,蓝藻细胞内含DNA微丝、内羹体、核糖体、气泡及贮藏颗粒等[1]．近年来,作者在蓝藻原生质球分离和培养［‘”］中注意到,有些无机盐对蓝藻细胞结构产生很大影响,并对受KO影响的住胞鱼腥藻细胞进行了亚显微结构检查,发现在KO影响下柱胞鱼腥藻细胞内形成液泡,这一发现在国内外尚属首次,为此简报如下．l材料和方法本试验使用住胞鱼腥藻（Anabaenarylindrica）,材料引自中国科学院水生生物研究所,培养条件参见文献［51。试验时,将材料培养于含0．lmoFLKO的液体培养…     

黄连-黄芩药对化学成分的UPLC-PDA-MS分析

本文建立了黄连-黄芩药对化学成分的UPLC-PDA-MS分析方法。实验采用ACQUITY UPLC BEH C18柱,流动相为0.05%甲酸水和甲醇梯度洗脱;检测波长280 nm;MS一级全扫描模式。综合分析标准品及不同样品的色谱峰保留时间、紫外光谱及MS一级全扫描质谱图,归属了黄连-黄芩提取液中的12个主要色谱峰,鉴别出8种成分,推断出2种成分,同时对鉴别出的8种成分进行了定量,被测成分在线性范围内均具有良好的线性关系(r≥0.9991),精密度、重复性的RSD均小于5.0%,加样回收率基本在95%～105%内。本方法快捷、准确,重复性好,能同时测定8个主要化学成分,可较全面地控制黄连-黄芩药对化学成分的含量。     

抗人AFP单链抗体与藻胆蛋白融合蛋白的构建、表达与活性分析

目的:构建多基因表达载体,在大肠杆菌中同时表达AFP单链抗体(scFv)和蓝藻别藻蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白(apcA)组成的融合蛋白(scFv-apcA)、藻胆蛋白裂合酶(cpcS)及藻红蛋白生物合成酶(Ho1和pebS),获得共价结合藻红胆素的融合蛋白(scFv-apcA-PEB)。方法:利用融合PCR将scFv和apcA基因连接起来,形成scFv-apcA融合基因,并将该融合基因与cpcS克隆到表达载体pCDFDuet-1中;将Ho1和pebS基因克隆到表达载体pRSFDuet-1中。将两种载体共转化到大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白表达,经亲和层析获得重组蛋白,通过光谱学分析和抗体竞争性抑制法,测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功表达融合蛋白scFv-apcA-PEB,分子质量约为45kDa,与理论值相符,其最大吸收峰为549.5nm,最大荧光发射峰为560nm,竞争抑制ELISA法初步鉴定活性,竞争抑制率达到48%。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了同时具有荧光特性和免疫学活性的重组蛋白。     

基于MALDI-TOF MS技术子宫内膜癌血清学诊断模型的建立及验证

目的:通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立子宫内膜癌(EC)血清学诊断模型。方法:收集53例EC初诊患者和37例子宫内膜良性病变患者血清,按照2∶1随机分为训练组60例(EC患者35例,良性病变患者25例)和验证组30例(EC患者18例,良性病变患者12例);通过弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)提取血清蛋白,经MALDI-TOF MS筛选差异蛋白。根据训练组中差异蛋白建立诊断模型,用验证组验证诊断模型的敏感性、特异性及诊断效率。结果:筛选出47个差异蛋白峰(P0.05),联合ROC曲线分析筛出AUC0.80的差异峰14个,其中在EC组表达上调的蛋白有7个;m/z分别为1779.63和1866.76 Da的2个蛋白峰差异性最显著,AUC分别为0.935和0.969,且EC组的平均峰值强度和峰下面积明显低于良性病变组。以上述2个蛋白建立诊断模型,经验证其敏感性为88.89%,特异性为91.67%,诊断效率为90%。结论:利用MALDI-TOF MS技术建立的EC血清学诊断模型有较高的敏感性和特异性,有望用于EC的早期筛查和辅助诊断。提示蛋白峰m/z 1779.63和1866.76 Da可能成为EC的潜在肿瘤标志物。     

铜尾矿废弃地生物土壤结皮固氮微生物多样性

生物土壤结皮能够有效提高矿业废弃地有机质和氮的积累,促进植被的恢复.本研究基于固氮微生物的nifH基因多样性,以铜陵铜尾矿废弃地3种类型的生物土壤结皮(藻结皮、藓结皮和藻-藓混合结皮)为对象,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究生物土壤结皮中固氮微生物的多样性以及废弃地植物群落发育对其产生的影响.结果表明： 尾矿库裸地表面的藻结皮的固氮微生物多样性最高,其次为维管植物群落下的藻-藓混合结皮,苔藓结皮的固氮蓝藻多样性最低;随着维管植物群落高度和盖度的增加,固氮微生物多样性降低,铜尾矿废弃地的pH、水分、有机质、养分含量(氮和磷)以及有效态和总重金属浓度对固氮微生物多样性的影响均不显著.测序和系统发育分析表明,废弃地结皮中固氮微生物以蓝藻为主,主要为不具有异形胞的丝状蓝藻.
     

水稻田中固氮蓝藻固氮活力的昼夜变化

蓝藻的固氮和光合作用密切联系,为了解固氮蓝藻在田间固氮活力的变化,我们对田间的蓝藻在不同生境下的固氮活力和昼夜变化进行现场(in situ)测定发现: 1.在不同生境中生长的各种固氮蓝藻的固氮活力的昼夜变化节律不尽相同,一般为一天出现一个活力高峰,在薄膜复盖培养池中高峰出现在中午(13∶00),而露田则在9∶00—12∶00之间;个别还出现两峰现象。2.不同种类的固氮蓝藻在田间的固氮活力有明显差别,混合藻种的酶活力最高,类颤鱼腥藻次之。3.不同生长期的类颤鱼腥藻的酶活力有明显不同。生长旺盛的活力高,衰老的活力低。4.稻田中不同小生境对蓝藻固氧酶活力有显著的影响,在水底生长的类颤鱼腥藻移至水面,其活力明显降低。根据蓝藻在田间的固氮活力的昼夜交化以及生境改变和生长状态对活力的影响,依估算生长良好的蓝藻在水田的固氮量最高可达285克氮/天/1000斤藓藻,最低51克氮,平均163克氮。假如在田间生长连续10天,即可固定1630克氮,相当于16.3斤的硫酸铵。但和测定的较高固氮活力(=258克氮/天相当于25.8斤硫铵)相比,固氮活力的潜力是相当大的。如能提高固氮蓝藻在田间的产量, 则其固氮量可大大增加。